65. В імуноферментних методах

антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і антитіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім пероксидази хрону може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людських тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при використанні технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулюючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в діагностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н₂О₂, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста, проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з іншими методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утворюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення.

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші антитіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші спрямовані проти гаптена, кон’юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості системи авідин-біотин. Авідин – глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінанти, які зв’язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, можна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн або лектин).

Замість авідину, кон’югованого з пероксидазою, в лабораторіях почали застосовувати комплекси авідин-біотин-пероксидаза. Техніка їх використання може бути двоетапною, коли вживаються біотиновані перші антитіла. Біотинована пероксидаза і авідин після змішування утворюють комплекси. Для цього методу вже розроблено комплекси авідину і біотинованої лужної фосфатази.

Техніка подвійної мітки. Останнім часом одержано моноклональні антитіла проти антигенів диференціації (CD), які можуть бути використані для точнішої характеристики різних типів клітин, у тому числі і для диференціації субпопуляцій лімфоцитів. На клітинах одночасно можна виявити два або більше різних антигенів, за якими вони відрізняються між собою.

Для подвійної мітки використовують методику з’єднання авідин-біотин-пероксидази із моноклональними мишачими антитілами. Одне моноклональне антитіло береться в комплексі авідин-біотин-лужна фосфатаза, при цьому утворюється продукт реакції голубого кольору. У наступному етапі забарвлення з іншим моноклональним антитілом, яке зв’язане з комплексом авідин-біотин-пероксидаза, призводить до виникнення червоного або бронзового продукту реакції. В обох випадках в якості іншого антитіла використовують кінські протимишачі антитіла.

Твердофазні імуноферментні методи.Принцип цих методів полягає в наступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджувану сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають субстрат для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчастіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики специфічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є модифікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердому носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сироватки зв’язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні антитіла, мічені ферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном, мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних антитіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном, фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостерігається висока активність ензиму.

Радіоімунні методи (РІМ)

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.

Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нукліди: тритій – ³H і йод – ¹²⁵J. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників g-проміння, в яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також авторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного зв’язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим більша кількість досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена зв’язується з антитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розміщене на твердій фазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в якому визначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв’язуватись з антитілом мічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі.

Метод “сендвіча” також використовується для дослідження антигенів. У даному випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До утвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке зв’язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить від кількості зв’язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для вивчення антигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження антитіл. Тоді антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану сироватку і мічений антиген. Кількість зв’язаного міченого антигена є пропорційною кількості досліджуваних антитіл.

Для дослідження алергенів і IgE використовують тести RAST (radioallergosorbent test), а також RIST (radioimmunosorbent test) або його модифікацію PRIST (paper-RIST для IgE). З алергенами, які адсорбовані на твердій фазі (фільтрувальний папір Ватман № 50, Сефадекс G-25, Сефароза 4b), реагують досліджувані антитіла IgE. На цей комплекс вносять мічені антитіла проти IgE. З допомогою цієї реакції можна виявляти незначні кількості (1-10 пг/мл) IgE. Відповідна модифікація цієї реакції дозволяє виявляти і алергени.

Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунологічних методів, вони дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Проте для їх виконання необхідні відповідні специфічні умови, які забезпечують проведення роботи з радіоактивними ізотопами. До недоліків слід віднести і недостатню стійкість радіоізотопних міток у порівнянні з ензимними.