60.Культура клітину вірусології.Типи культур клітин.Умови культивування та середовища для культури клітин

. Клітинні культури — це генетично однорідні популяції клітин, що ростуть у постійних умовах оточуючого середовища. Це можуть бути штаминормальних клітин 

. Типи культур клітин[

1. Первинно-трипсинізовані — отримують із подрібнених тканин людини та тварин шляхом їх обробки трипсином чи іншими ферментами. Витримують лише 5-10 поділів (пасажів).

2. Перещеплювані — клітини, які набули здатності до безмежного розмноження, оскільки є похідними пухлин людини та тварин.

3. Напівперещеплювані (диплоїдні) — можуть витримувати до 100 пасажів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом.

Умови культивування

Флакони із культуральним середовищем для вирощування тваринних клітин

Клітини звичайно поміщають у скляні посудини, звідси і дослідження отримали назву вивчення in vitro (від лат. in — в, vitro — скло), хоча тепер частіше культури вирощують у пластмасових посудинах. Виділені з тканин клітини інкубують при температурі +38 °C +39 °C (для клітин тваринного і людського організмів) та при +22 °C +28 °C (для рослинних клітин) у живильному середовищі відповідного складу. Клітини тоді ростуть у вигляді суспензії або моношару. Суспензійна культура — це вирощування окремих клітин або невеликих їх груп у завислому стані у рідкому живильному середовищі з використанням апаратури, що забезпечує їх аерацію і перемішування. Характерною особливістю суспензійних культур є їх морфологічната біохімічна гетерогенність. Клітинна популяція містить клітини, які відрізняються за розміром і формою.

61Виявляти віруси в культурі тканин можна за феноменом бляшкоутворення.

Останнім часом досліджують утворення бляшок під бентонітовим живильним покриттям. Попередньо готують десятикратні розведення досліджуваного матеріалу, яким заражають відповідні культури клітин. Після 30-хвилинної інкубації їх відмивають стерильним фіpозчином і заливають бентонітовим покриттям, яке містить бентонітовий гель, розчин Ерла, нативну бичачу сироватку, гідрокарбонат натрію, дистильовану воду і розчини антибіотиків для пригнічення сторонньої мікрофлори. Адсорбуючись на поверхні клітин, бентоніт надає моношару клітин молочного кольору. Внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується тільки первинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється формуванням вогнищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок. Деякі віруси (натуральної віспи, простого герпесу) мають характерну цитопатичну дію, яка проявляється утворенням особливих бляшок на поверхні хоріоналантоїсної оболонки. Вони опуклі, мають дрібні розміри, білуватий колірРепродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграціїферментативною обробкою. Для цього отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25 % розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв’язків між клітинами) можна проводити при температурі 37 °С або 4 °С.Після цього суспензію центрифугують, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визначають при підрахунку в камері Горяєва.

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин або їх росту, бувають природними або синтетичними (штучними). Природні середовища – сироватка крові великої рогатої худоби, рідини із серозних порожнин, продукти гідролізу молока, різноманітні гідролізати (5 % гемогідролізат, 0,5 % гідролізат лактальбуміну) або екстракти тканин. Їх хімічний склад допомагає створити умови, які подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недоліком таких середовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний склад компонентів, які входять до їх складу, може змінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже їх хімічний склад стандартний, тому що їх одержують, комбінуючи різноманітні сольові розчини (вітаміни, амінокислоти) в штучних умовах. До таких найбільш вживаних розчинів належать середовище 199 (культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин), середовище Ігла (містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин), середовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин Хенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмивання клітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в лабораторіях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, аденовірусів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, аденовірусів, вірусів кору, паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої мавпи (культивування поліовірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих ембріонів (культивування різноманітних арбовірусів), нирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденовірусів, пікорнавірусів, реовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання суворих правил асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування мікроорганізмами, грибами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матеріалу або повітря спричиняє їх загибель. Тоді неможливо оцінити цитопатичний ефект вірусів, оскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобігання цього до живильних середовищ і досліджуваного матеріалу додають розчини антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну (100 ОД/мл, стрептоміцину (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, лінкоміцину, протигрибкових препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або інших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур клітин є неможливість тривалий час підтримувати їх у лабораторних умовах, адже вони здатні витримувати тільки до 10 пасажів in vitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони представляють собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту і розмноження. Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи тваринних тканин, що мають змінений каріотип. Вони широко використовуються в лабораторній практиці, оскільки здатні швидко та інтенсивно розмножуватись у пробірках і чутливі до багатьох вірусів. Їх отримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у вигляді одношарових культур, прикріплених до поверхні скла, у спеціальних матрацах, флаконах або пробірках. Найчастіше використовують лінії культур клітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp2 (карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини людини), RD (рабдоміосаркома людини), RH (нирка ембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи), СПЭВ (нирка ембріона свині), ВНК-32 (нирка сирійського хом’яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин відбирають ті з них, які мають типову морфологію, чітко відмежовані одна від іншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні клітини. Вони представляють собою культури клітин одного типу, мають диплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отримання вакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідними вірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної активності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, через що їхрідко використовують у практиці звичайних вірусологічних лабораторій. Найчастіше користуються лініями культур, які одержано із фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього спочатку одержують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у живильному середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10⁶ в 1 мл. Для стабілізації клітиндо складу середовища додають 10-20 % сироватки крові та гліцерин. Отриману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і поступово заморожують до –20 °С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при температурі –196 °С. Доведено, що за таких умов життєздатність культур клітин не змінюється протягом невизначеного часу. У разі потреби культури швидко розморожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38 °С.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграціїферментативною обробкою. Для цього отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25 % розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв’язків між клітинами) можна проводити при температурі 37 °С або 4 °С.Після цього суспензію центрифугують, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визначають при підрахунку в камері Горяєва.

Живильні середовища, які використовуються для підтримання культур клітин або їх росту, бувають природними або синтетичними (штучними). Природні середовища – сироватка крові великої рогатої худоби, рідини із серозних порожнин, продукти гідролізу молока, різноманітні гідролізати (5 % гемогідролізат, 0,5 % гідролізат лактальбуміну) або екстракти тканин. Їх хімічний склад допомагає створити умови, які подібні до тих, що існують в організмі людини. Суттєвим недоліком таких середовищ вважається їх нестандартність, адже якісний і кількісний склад компонентів, які входять до їх складу, може змінюватися.

Синтетичні живильні середовища не мають цього недоліку, адже їх хімічний склад стандартний, тому що їх одержують, комбінуючи різноманітні сольові розчини (вітаміни, амінокислоти) в штучних умовах. До таких найбільш вживаних розчинів належать середовище 199 (культивування первинно-трипсинізованих і перещеплюваних культур клітин), середовище Ігла (містить мінімальний набір амінокислот і вітамінів та використовується для культивування різних ліній клітин), середовище Ігла МЕМ (культивування особливо вимогливих ліній клітин), розчин Хенкса, що використовується для виготовлення живильних середовищ, відмивання клітин тощо.

Для одержання первинно-трипсинізованих культур найчастіше в лабораторіях використовують нирки ембріонів людини (для виділення вірусів кору, аденовірусів), нирки макаки-резус (для виділення поліовірусів, аденовірусів, вірусів кору, паротиту, гепатиту А), нирки африканської зеленої мавпи (культивування поліовірусів, тогавірусів, флавівірусів), клітин курячих ембріонів (культивування різноманітних арбовірусів), нирки ембріона свині (виділення вірусів грипу, аденовірусів, пікорнавірусів, реовірусів) та інші.

Важливою умовою культивування ліній клітин є дотримання суворих правил асептики. Це робиться для запобігання їх контамінування мікроорганізмами, грибами. Адже попадання бактерій в культури клітини із досліджуваного матеріалу або повітря спричиняє їх загибель. Тоді неможливо оцінити цитопатичний ефект вірусів, оскільки у цьому випадку невідома причина загибелі клітин. Для запобігання цього до живильних середовищ і досліджуваного матеріалу додають розчини антибіотиків з різними механізмами дії: пеніциліну (100 ОД/мл, стрептоміцину (100 мкг/мл), неоміцину, канаміцину, гентаміцину, лінкоміцину, протигрибкових препаратів ністатину (50 ОД/мл), афотерицину В або інших.

Одним з недоліків первинно-трипсінізованих ліній культур клітин є неможливість тривалий час підтримувати їх у лабораторних умовах, адже вони здатні витримувати тільки до 10 пасажів in vitro.

Іншою групою культур клітин є перещеплювані клітини. Вони представляють собою культури клітин, які набули здатності до необмеженого росту і розмноження. Їх одержують із злоякісних пухлин або з нормальних людських чи тваринних тканин, що мають змінений каріотип. Вони широко використовуються в лабораторній практиці, оскільки здатні швидко та інтенсивно розмножуватись у пробірках і чутливі до багатьох вірусів. Їх отримують із центральних банків тканинних культур.

Ці культури вирощують, як правило, у вигляді одношарових культур, прикріплених до поверхні скла, у спеціальних матрацах, флаконах або пробірках. Найчастіше використовують лінії культур клітин HeLa (карцинома шийки матки), HЕp2 (карцинома гортані людини), КВ (карцинома ротової порожнини людини), RD (рабдоміосаркома людини), RH (нирка ембріона людини), Vero (нирка зеленої мавпи), СПЭВ (нирка ембріона свині), ВНК-32 (нирка сирійського хом’яка) та інші.

Для підтримання ліній клітин відбирають ті з них, які мають типову морфологію, чітко відмежовані одна від іншої, не мають вакуолей і включень.

Третьою групою є диплоїдні клітини. Вони представляють собою культури клітин одного типу, мають диплоїдний набір хромосом і здатні витримувати при цьому до 100 пересівів в умовах лабораторії. Вони є зручною моделлю для отримання вакцинних препаратів вірусів, оскільки вільні від контамінації чужорідними вірусами, зберігають вихідний каріотип під час пасажів, не мають онкогенної активності. У той же час вони надзвичайно вибагливі до умов культивування, через що їхрідко використовують у практиці звичайних вірусологічних лабораторій. Найчастіше користуються лініями культур, які одержано із фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець тощо.

Культури клітин зберігають у замороженому стані. Для цього спочатку одержують моношар клітин 4-6-денного віку, а потім суспендують їх у живильному середовищі, щоб отримати концентрацію клітин до 10⁶ в 1 мл. Для стабілізації клітиндо складу середовища додають 10-20 % сироватки крові та гліцерин. Отриману суспензію розливають у стерильних умовах в ампули і поступово заморожують до –20 °С. Зберігають клітини у спеціальних посудинах з рідким азотом при температурі –196 °С. Доведено, що за таких умов життєздатність культур клітин не змінюється протягом невизначеного часу. У разі потреби культури швидко розморожують, використовуючи водяну баню, при температурі 37-38 °С.

62. Основні етапи патогенезу вірусних інфекційПроникнення вірусу в організм. Основні вхідні ворота для збудників вірусних інфекції людини - дихальні шляхи і шлунково-кишкового тракту, рідше - шкірні покриви. В деяких випадках розвиваються локальні поразки, але частіше в місці проникнення не виникає будь-яких проявів або вони носять стертий характер, а збудник мігрує в чутливі тканини. Поширення збудника в організмі може носити локальний чи системний характер.Локальні ураження вірусами типові для збудників респіраторних та кишкових інфекцій, а також для деяких шкірних захворювань. Тривалість інкубаційного періоду більшості подібних інфекцій становить 2-3 доби. Первинну реплікацію часто супроводжує вірусемія. Вона зазвичай протікає безсимптомно або по типу продромальних явищ, але може виникати і на тлі вираженої клінічної картини, не викликаючи розвитку додаткової симптоматики. Для подібних захворювань характерно повторне зараження, так як циркулюють AT не виявляють протективний ефект, а секреторний імуноглобулін А (IgA) надає лише короткочасне нейтралізує дію на слизовій оболонці. Системні ураження. З місця проникнення збудники потрапляють в кровотік, викликаючи вірусемія, і поступово фіксуються в чутливих тканинах. Первинне розповсюдження зазвичай викликає продромальний явища. Оскільки вірусемія передує поразці чутливих тканин, то тривалість інкубаційного і продромального періодів подібних інфекцій можуть збільшуватися до 2-3 тижнів. Вірусемія при системних інфекціях зазвичай носить двоетапний характер. Перший етап закінчується поглинанням циркулюючих вірусів клітинами ретикулоендотеліальної системи.Надалі можливо кілька варіантів:

• повна елімінація збудника (абортивна інфекція);

• розмноження вірусів в фагоцитах з подальшим виходом і розвитком вираженої вторинної вірусемії, що супроводжується появою характерних клінічних ознак захворювання (наприклад, енцефалітів);

• деякі віруси (Наприклад, вірус гепатиту В, пікорна-і тогавирусов) слабо поглинаються фагоцитами і можуть циркулювати в крові у вільному стані, а збудники колорадській кліщовий лихоманки і лихоманки долини Ріфт впроваджуються в еритроцити.

Основні органи-мішені найбільш поширених вірусних інфекцій представлені на рис. 5-9. Багато із зазначених на малюнку збудників можуть вражати, крім названих, та інші тканини (так, поліовіруси здатні викликати ураження шлунково-кишкового тракту, а вірус епідемічного паротиту має тропність до епітелію звивистих канальців яєчок)

63. Імунітет-

це сукупність процесів, спрямованих на захист організму від генетично чужорідних субстанції і збереження постійності внутрішнього середовища (гомеостазу).

У поняття противірусного імунітету входять три категорії захисних механізмів:

1) природна видова резистентність;

2) неспецифічні клітинні і загально фізіологічні реакції (участь інтерферону, неспецифічних інгібіторів, фізіологічна температура тіла, піноцитоз вірусних часток, фагоцитоз заражених вірусом кліток);

3) специфічний набутий імунітет після перенесеного захворювання чи імунізації (утворення його зв'язане за участю В-лімфоцитів у продукції антитіл класу G, М, А і Е, а також за участю Т- лімфоцитів).

 Фактори і механізми противірусного імунітету мають свої особливості, що відрізняють їх від імунних реакцій у відношенні бактерій та інших патогенних агентів тваринного і рослинного походження. Ці особливості визначається природою вірусів. Їх абсолютним внутрішньоклітинним паразитизмом на генетичному рівні. Вірусна інфекція - це перш за все інфекція чутливих клітин. Взаємодія вірусу та сприйнятливих клітин лежить в основі патогенезу вірусного захворювання. Поза клітинами віруси можуть зберігати життєздатність, але не розмножується, бо не мають власних білок синтезуючих систем.

Захист клітини від вірусної генетичної інформації та пригнічення репродукції вірусу є кардинальною особливістю противірусного імунітету. Відмічаючи його специфіку, не треба забувати, що захисні реакції організму, спрямовані проти вірусів, підкоряється загальним імунологічним закономірностям. Антигени, імунокомпетентні клітини та антитіла лежать в основі специфічної імунної відповіді по відношенню до будь-яких генетично чужорідних агентів, в тому числі і вірусів.

інтерферон — особливий противірусний білок, який продукується зараженими клітинами чи цілим організмом. Відкрили його англійські вірусологи Айзекс і Лінденман (1957). 

 Властивості інтерферону. Існує не один інтерферон, а інтерферони, тобто не єдиний білок, а клас білків, що розрізняються різною молекулярною масою (ММ) й іншими параметрами. По антигенній специфічності інтерферони поділяються на альфа, бета  і гама, що відповідає колишнім позначенням лейкоцитарного, фібробластного й імунного (тип II) інтерферону.

 Індукція інтерферону. У клітинах людини мається 27 генетичних локусів для інтерферонів, з яких 14 є функціонуючими. Інтерферони закодовані в генетичному апараті клітини. 

Система інтерферону не має центрального органа, тому що здатністю виробляти інтерферон володіють усі клітини організму хребетних, хоча найбільше активно виробляють його клітини білої крові. Інтерферон спонтанно не продукується інтактними клітинами, а для утворення його потрібні індуктори, якими можуть бути віруси, бактеріальні токсини, рикетсії, екстракти з бактерій і грибів, фітогемаглютиніни, синтетичні речовини - полікарбоксили, полісульфати, декстрани, але найбільш ефективними індукторами інтерферону є двоспіральні РНК, убиті і живі віруси.  

Механізм утворення інтерферону в клітині. Генетично інформація для продукції інтерферону міститься в ДНК клітини, і для його утворення в клітині необхідний попередній синтез інформаційної РНК на матриці клітинної ДНК у перші години після зараження. Реплікацію іРНК для інтерферонів каталізує клітинна РНК-полімераза. 

Весь інтерферон у клітках синтезується після індукції de novo. Практично всі клітини тією чи іншою мірою здатні утворювати інтерферон, крім кліток лінії Vero. Проміжок часу між початковою взаємодією індуктора і клітини (адсорбція індуктора) і появою інтерферону, розглядається як lag-період, залежить від характеру системи індуктор - клітина. При використанні як індуктор вірусу lag-період здебільшого триває 4 — 8 годин.

При деяких вірусних інфекціях інтерферон продукується в значних кількостях у тканинах, уражених тим чи іншим вірусом. По характеру інтерферони поділяють на два типи: I тип — «класичний», чи кислотостійкий; II тип – імунний, чи нестійкий до кислоти.

Яка ж роль імунокомпетентних клітин у продукції інтерферону I і II типів? Інтерферони II типу продукуються лімфоцитами у відповідь на вплив мітогенів чи попередньо сенсибілізованими лімфоцитами у відповідь на відповідний антиген. Інтерферон I типу синтезують популяції лімфоцитів з периферичної крові, молозива і молока у відповідь на вірусну інфекцію. При цьому рівень утворення його прямо пропорційний кількості узятих у досвіді як лімфоцитів, так і макрофагів.

Вплив інтерферону на кілерну активність клітин. Інтерферон сприяє або збільшенню кілерної активності сенсибілізованих Т-лімфоцитів, або індукує функцію в клітин, що до впливу інтерферону нею не володіли.

Фактори, що впливають на утворення ендогенного інтерферону. Організм реагує на вторгнення вірусу посиленим утворенням інтерферону в клітинах ураженої тканини і тим самим перешкоджає розмноженню вірусу, нейтралізує його дію. Одним з факторів, що визначають резистентність організму, і є здатність його тканин виробляти інтерферон. У різних тварин вона неоднакова і визначається уродженими особливостями організму і віком.

На вироблення інтерферону тканинами організму впливають і зовнішні умови, наприклад погода, температура повітря; узимку і восени організм виробляє менше інтерферону, чим у теплий час року. Мабуть тому влітку люди значно рідше хворіють на грип.

Вікові особливості в становленні системи утворення інтерферону. Існують обумовлені віком закономірності утворення інтерферону у людини. Було доведено, що в процесі росту організму кількість інгібіторів інтерфероноутворення в плазмі крові зменшується, а кількість факторів, що активізують цей процес, зростає.

Чутливість репродукції вірусів до інтерферону. Одна з основних властивостей інтерферону - придушувати розмноження багатьох гетерологічних вірусів. До інтерферону чуттєві усі відомі в даний час віруси, однак їх чутливість неоднакова. Найбільш чуттєві віруси, що мають зовнішню оболонку й утримуючі ліпіди (міксовіруси, група вірусів віспи, арбовіруси), тоді як пікорна- і аденовіруси, позбавлені зовнішньої оболонки, більш стійкі до дії інтерферону. Мається і певні виключення: віруси герпесу з добре розвинутою оболонкою стійкі до дії інтерферону. Найбільш чуттєві в тканевих культурах арбовіруси. Тому вони використовуються як модель для перевірки активності інтерферону.