- •Предмет, завдання і методологія біотехнології рослин
- •Історія розвитку методу культури клітин, тканин та органів рослин
- •Організація і обладнання біотехнологічної лабораторії
- •Посуд, інструменти і матеріали
- •Миття посуду
- •Методи стерилізації посуду
- •Методи стерилізації інструментів
- •Контрольні запитання і завдання
- •Живлення культури тканин
- •Мінеральне живлення
- •Вуглеводневе живлення
- •Вітаміни
- •Стимулятори росту
- •Фітогормони
- •Рослинні екстракти
- •РН – середовища
- •Приготування живильних середовищ
- •Стерилізація живильних середовищ
- •Стерилізація рослинного матеріалу
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих органів і зародків
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих клітин і тканин
- •Культура калюсних тканин
- •Особливості калюсних клітин
- •Генетика калюсних клітин
- •Культура клітинних суспензій
- •Культивування ізольованих клітин
- •Методи оцінки результатів
- •Мікроклональне розмноження рослин
- •Методи мікроклонального розмноження рослин
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Кріоконсервація клітин рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Клітинна селекція
- •Спонтанні та індуковані мутанти
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура рослинних клітин і речовини вторинного синтезу
- •Фактори, які впливають на вихід продуктів
- •Компоненти середовища
- •Фізичні фактори
- •Селекція і відбір
- •Утворення вторинних речовин в культурах рослинних тканин
- •Глікозиди
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих протопластів і соматична гібридизація
- •Виділення і очистка ізольованих протопластів картоплі
- •Виділення протопластів із мезофілу листка
- •Виділення протопластів із культури клітин
- •Культивування ізольованих протопластів
- •Умови культивування протопластів
- •Злиття ізольованих протопластів
- •Селекція соматичних гібридів
- •Генетична трансформація
- •Вектори для генетичної трансформації рослин
- •Плазміди агробактерій як вектори для трансформації
- •Вектори на основі днк-вмісних вірусів рослин
- •Методи перенесення чужинних генів у рослини
- •Трансгени і екологія
- •Контрольні запитання і завдання
- •Практичний курс Приготування і стерилізація живильних середовищ
- •Таблиця 8
- •Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (мс)
- •Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (мс). Стерилізація середовища автоклавуванням
- •Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)
- •Стерилізація рослинного матеріалу Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування асептичних рослин
- •Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ
- •Робота 6. Стерилізація листків
- •Робота 7. Стерилізація меристем
- •Калюсна культура Робота 8. Отримання первинного калюсу із різних експлантатів асептичних рослин
- •Робота 9. Дослідження явища фізіологічної полярності
- •Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури
- •Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип
- •КлітиннА суспензіЯ Робота 12. Отримання клітинної суспензії з калюсної тканини
- •Мікроклональне розмноження рослин Робота 13. Мікроклональне розмноження рослин живцями
- •Робота 14. Стебловий органогенез із листкових дисків тютюну
- •Таблиця 15 Середовища для мікроклонального розмноження тютюну та моркви (1 л середовища)
- •Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну
- •Робота 16. Прямий ембріогенез
- •Хід роботи
- •Робота 17. Непрямий ембріогенез
- •Культура ізольованих протопластів вищих рослин Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин
- •Словник термінів
- •Список літератури
Мінеральне живлення
Макроелементи. Азот. Рослинні тканини, що ростуть в ізольованій культурі, автотрофи у відношенні азотного живлення. Із неорганічного азоту вони синтезують всі необхідні для їх життєдіяльності органічні азотисті сполуки. Джерелами молекулярного азоту є мінеральні солі, амінокислоти.
Кращою формою азотного живлення рослинних тканин є нітрати, які як основне джерело азоту вводяться у середовища у концентраціях 2-25 мМ. Спроби використати джерелом азоту нітрити показали, що вони не могли замінити нітрати: низькі концентрації нітритів були недостатні для оптимального росту рослинних тканин, а великі - токсичні. Кращі результати, ніж при використанні нітритів, отримують при застосуванні, в якості джерела азоту, амонійних солей. Однак, амоній значно менш ефективний як джерело азоту ніж нітрати. Проте, заміна 10-20% нітратів на солі амонію покращує ріст рослинних тканин. Так до складу середовища Гамборга, на якому добре ростуть дводольні і однодольні рослини, крім нітрату (25 мМ) входять і амонійні солі (2 мМ). У деяких випадках для інтенсивного росту калюсних і суспензійних культур сумарну концентрацію нітрату і аміаку доцільно збільшити до 60 мМ.
Азот живильного середовища впливає на морфогенетичні можливості тканини: залежно від нітратної чи амонійної форми азоту індукуються пагони або корені, бруньки або ембріоїди.
При культивуванні рослинних тканин як єдине джерело азоту можна використовувати амінокислоти в L-конформації. Але для більшості культур тканин одна амінокислота або навіть їхня суміш неефективні як єдине джерело азоту, бо ріст цих культур значно повільніший, ніж на середовищах з нітратами. Це може бути обумовлене тим, що амінокислоти не завжди можуть активно дезамінуватися або аміак, що утворився, не може бути використаним для синтезу первинних продуктів. Другою причиною може бути потреба в самих нітратах, оскільки деякі проміжні сполуки відновлення нітратів беруть участь в біосинтезі важливих азотистих метаболітів. Слід зазначити, що ріст ряду ізольованих рослинних тканин активується при введені до складу нітратвмісного середовища окремих амінокислот, найчастіше гліцину, або їхніх сумішей, наприклад, гідролізат казеїну, пектон.
Сірку вводять до складу живильних середовищ у вигляді сульфату, сульфіту, цистеїну, глутатіону або метіоніну. Для більшості тканин найкращим джерелом сірки є сульфати.
Для росту калюсних тканин і ізольованих органів необхідним компонентом середовищ є фосфор. Тканини, які інтенсивно ростуть, особливо чутливі до вмісту фосфору у живильному середовищі і краще ростуть на середовищах багатих фосфором. Як джерело фосфорного живлення, в основному, використовується ортофосфат, але можна використовувати різні фосфати цукрів.
Залізо вводиться у вигляді неорганічних солей (FeCl3, Fe2(SO4)3) і солей органічних кислот (цитрат і тартрат заліза). Але метаболіти, які виділяють культури тканин, і рН середовища впливають на засвоєння заліза рослинними тканинами. Тому більшість середовищ містять цей елемент в хелатованій формі у комплексі з етилендіамінтетраоцтовою кислотою (ЕДТА). Це покращує доступність заліза при рН до 8,0 впродовж всього періоду росту культури, тоді як відсутність хелатуючого агента може дуже швидко призвести до нестачі його.
Потреба тканини в елементах мінерального живлення залежить від її фізіологічних особливостей. Для молодих швидкоростучих тканин, необхідна наявність у середовищі високих доз калію (К+), тоді як старі тканини, навпаки, вибагливі до наявності кальцію (Са2+). Так, оптимальна доза кальцію для молодої тканини моркви – 0,25 мМ, для старої тканини ця доза підвищується до 3 мМ.
При відсутності у середовищі калію (К+) уже в першому пасажі культури тканин моркви спостерігається пригнічення росту і некрози; у другому пасажі на такому живильному середовищі ріст припиняється і тканина відмирає. Однак перенесення на середовище, яке нормально забезпечене калієм (К+), поновлює ріст тканини моркви, навіть якщо перед цим її вирощували на середовищі без калію (К+) впродовж двох пасажів.
В результаті ретельного вивчення мінерального живлення ізольованих рослинних тканин дослідники дійшли висновку, що відсутність у живильному середовищі N, K, Ca, Mg, S, P призводить до загибелі культури у першому або у другому пасажі. Наявність Na+ і Cl- не обов’язкова, хоча додавання NaCl в середовище стимулює ріст рослинних тканин. Для більшості елементів існує оптимум концентрації, але його перевищення інколи має токсичну дію.
Крім макроелементів до складу більшості живильних середовищ входять мікроелементи. Додавання до живильного середовища мікроелементів особливо важливе при культивуванні тканин в рідкому середовищі. Відсутність мікроелементів зменшує інтенсивність росту культур на 40 % у першому пасажі і приводить культури до загибелі протягом двох наступних.
При вирощуванні тканин на агаровому живильному середовищі вони не так гостро реагують на відсутність мікроелементів, так як в агарі міститься багато мікроелементів і деякі макроелементи. Однак повнота вмісту мікроелементів в агарі викликає сумніви, а тому більшість дослідників додають повну суміш мікроелементів і до агарових середовищ. Найчастіше використовують суміш мікроелементів середовища Мурасиге і Скуга (МС).
Мікроелементи необхідні для функціонування ферментів та кофакторів.