Контрольні запитання і завдання
1. Що таке мікроклональне розмноження?
2. Який коефіцієнт мікроклонального розмноження?
3. Назвіть основні переваги мікроклонального розмноження над традиційним.
4. Що таке меристемоїди? Яка частота їх утворення?
5. Які морфологічні ознаки меристемоїдів?
6. Від яких факторів залежить здатність рослинної клітини реалізувати властиву їй тотипотентність?
7. Перерахуйте методи мікроклонального розмноження.
8. Охарактеризуйте соматичний ембріогенез як спосіб мікроклонального розмноження рослин.
9. Назвіть фази розвитку соматичного зародка.
10. Назвіть етапи мікроклонального розмноження рослин.
Кріоконсервація клітин рослин
Кріобіологія (від грецького kryos – холод, мороз, лід) – розділ біології, який вивчає дію на живі системи низьких та наднизьких температур (від 00 С до абсолютного нуля).
Як наука кріобіологія почала розвиватися у кінці ХІХ століття.
Кріозбереження буквально означає збереження у замороженому стані. Це складний багатоетапний процес, метою якого є необмежене тривале зберігання життєздатних клітин, меристем або органів рослин в стані холодового анабіозу. Однак на практиці звичайно це зберігання при дуже низьких температурах: при температурі сухого льоду (- 74 °С), в морозильниках з ультранизькою температурою (- 80 °С і нижче), в рідкому азоті (- 196 °С) або його парах (≈ ‑ 140 °C).
Головна перевага зберігання при дуже низьких температурах полягає у здатності значно сповільнювати або навіть зупиняти метаболічні процеси і біологічне руйнування. Крім того, матеріал, який зберігається при низьких температурах, залишається генетично стабільним, і у цьому випадку, можна уникнути генетичних змін, які властиві організмам, що підтримуються звичайними способами.
Кріозбереження сприяє також помітній економії витрат на обладнання і зарплату персоналу, а також зменшує ризик втрати цінного матеріалу внаслідок забруднення, помилок або несправності обладнання.
Для більшості соматичних клітин і сперміїв ряду видів тварин кріоконсервація стала звичайною процедурою. В той час як для рослинних клітин все ще немає універсального методу, який був би придатним для їх кріозбереження. Більше того, як правило, навіть штами, похідні від одного вихідного, потребують різних умов на деяких важливих етапах цієї екстремальної процедури. І все ж у світі досягли кріозбереження (при – 196 °С) культур клітин майже для 40 видів рослин і культур апікальних меристем ще 25 видів.
Причина такого відносно повільного просування пов’язана не лише з недостатньою увагою до цієї проблеми, але перш за все зі специфікою рослинних клітин: великими розмірами, значною вакуолізацією, великою кількістю води та надзвичайно широкою пластичністю їхнього метаболізму, оскільки вони перебувають у більш мінливих умовах, ніж умови строгого гомеостазу внутрішнього середовища, яке оточує клітини тварин. Тому виживання клітин після розморожування навіть у кращих, рідких випадках не перевищує 60–70 %.
Пошкодження клітин при заморожуванні і послідуючому відтаюванні залежать від утворення льоду всередині клітин і від їх дегідратації. Небезпечним є ріст центрів кристалізації у крупні кристали (понад 0,1 мкм), чиї грани руйнують ендомембрани. Швидкість росту кристалів сильно зростає при збільшенні ступеня переохолодження води. Повністю ріст і перебудова кристалів льоду зупиняються у чистій воді тільки при – 140 °С. Ось чому тривале зберігання можливе тільки при більш низьких температурах.
Точка замерзання цитоплазми ≈ - 1 °С, кріопротектори знижують її до ‑ 3,5 °C, але клітини, як правило, не замерзають до - 10–15 °С, бо за цих температур плазмалема ще запобігає проникненню всередину кристалів льоду, які ростуть у зовнішньому розчині. Отже на момент ініціації кристалізації у клітині уже існує значне переохолодження, що дуже несприятливо. Але якщо температура знижується досить повільно, то вільна вода встигає вийти із клітини. Відбувається значна дегідратація і стиснення протопласта, тобто плазмоліз. Пошкодження, які виникають можуть мати різні механізми, але провідну роль для клітин рослин, якщо в середині них не утворюються великі кристали льоду, при зниженні температури до – 25 °С відіграє надмірний плазмоліз і послідуюча повна втрата осмотичної реактивності в результаті порушення цілісності плазмалеми.
Кріозбереження як система єдиного екстремального процесу (заморожування–зберігання-розморожування) складається з таких елементів: підготовка об’єкту, додавання кріопротектора, заморожування в певному режимі, зберігання в рідкому азоті, розморожування, видалення кріопротекторів (відмивка), рекультивація (для клітин), регенерація цілих рослин (Рис. 4).
Рис.4. Схема технології кріозбереження меристем у рідкому азоті:
1 – вилучення меристем; 2 – підготовка об’єкту, додавання кріопротекторів; 3 – кріозбереження у рідкому азоті; 4 – розморожування, посадка на середовище для регенерації.
Кріоконсервація культур клітин і меристем рослин на відміну від клітин тварин у багатьох випадках починається з етапу спеціальної підготовки, хоча є культури, для яких він не обов’язковий. Але і такі культури для заморожування варто брати на початку або всередині експоненціальної фази росту, коли вони збагачені меристемоїдними клітинами. Звідси найпростіший спосіб підготовки полягає у частому пересаджуванні культури , що дозволяє підтримувати її майже постійно в ранній експоненціальній фазі. Іноді пересадки роблять кожні 2 – 4 доби.
Інші способи потребують попереднього культивування у певних умовах. При одному із способів у середовище додавали маніт або сорбіт у концентрації 2 – 6 % на період від кількох діб до 2 – 3 пасажів. Такий спосіб зменшував розмір клітин і, що важливіше, їх вакуолей, значно покращував виживання клітин явора, моркви, перцю, забезпечував кріозбереження багатьох штамів. Іноді концентрацію сорбіту підвищують до 1 М (18,2 %), але не довше ніж на добу.
При другому способі передкультивуванння використовують амінокислоти і в першу чергу пролін, який має значення для зв’язування води у клітинах рослин. Його концентрацію поступово підвищували для ряду клітин до 1 М (11,5 %) на строк до 4 діб. Але клітини деяких видів дуже чутливі до проліну, навіть при короткочасній (1 – 2 год) інкубації. Наприклад, для клітин діоскореї використовували низькі концентрації (0,01 – 0,05 М) і не тільки проліну, але і аланіну, серину і аспарагіну протягом 4 – 6 діб. Найкращі результати були отримані з аспарагіном, інші амінокислоти були менш ефективні. Показано, що замість проліну або разом з ним у ряду видів рослин значна роль в осморегуляції належить аспарагіну або гліцину. Крім названих речовин для попереднього культивування і кріозахисту використовували γ-аміномасляну кислоту.
Третій спосіб передкультивування – додавання у середовище кріопротекторів – речовин, які зв’язують вільну воду як в міжклітинниках, так і в клітинах; ускладнюють її кристалізацію за рахунок утворення з нею водневих зв’язків; зменшують ущільнення протопластів клітин при заморожуванні.
Найефективнішими кріопротекторами є диметилсульфоксид (ДМСО), етиленгліколь і його похідні, пролін, гліцерин, сахароза і глюкоза. Крім того є повідомлення про кріозахисну дію і інших (крім проліну) амінокислот і близьких сполук (гліцин-бетаін, γ-аміномасляна кислота, оксипролін і аспартат). Всі ці речовини використовують як окремо, так і в комбінаціях, що дозволяє зменшити їхню токсичність. Наприклад, ПЕГ з середньою мол. масою 6000 діє саме таким чином, оскільки сам не захищає. Рідко як кріопротектор використовують трегалозу, яка у концентрації 15% виявилась у 1,5 рази ефективнішою, ніж 7%-й ДМСО, а 20% - майже на рівні ДМСО. Особливо ефективним було використання суміші трегалози з ДМСО та сахарозою.
Спочатку цей спосіб передкультивування використовували тільки для апексів пагонів.
Для передкультивування з кріопротекторами слід використовувати рідке середовище і містки із фільтрувального паперу.
Четвертий спосіб попереднього культивування відбувається в умовах штучного загартовування, його краще застосовувати для зимуючих рослин помірного клімату. Для клітинних, тканинних і органних культур не зимуючих рослин цей спосіб непридатний. У разі культур меристем доцільно попередньо загартовувати самі рослини із яких потім вирізають меристеми і культивують їх на середовищі з ДМСО. Суть загартування полягає в імітації природного осіннього процесу підготовки рослин до періоду зимового спокою. У різних груп рослин цитофізіологічні механізми такої підготовки різні. При роботі з клітинними суспензійними або калюсними культурами звичайно їх або зразу поміщають в умови з температурою від 2°С до 5°С на строк від 1 до 6 тижнів, або спочатку протягом кількох діб витримують при температурі 8–10 °С. Ефективнішим є загартування у присутності сахарози. Для калюсних культур її додають до 12 – 15 %.
Для перед- і рекультивування рослинних тканин використовують середовище Мурасиге і Скуга (МС) із 2% сахарозою, вітамінами за Стабом, інозитом – 100, кінетином - 0,5, гібереловою кислотою – 2, аденіном – 40 мг/л.
Вибір способу підготовки залежить від об’єкта і його особливостей.
Після підготовки перед додаванням кріопротекторів клітинні суспензії концентрують. Оскільки центрифугування (навіть протягом 5 хв при 100 g) пошкоджує багато рослинних клітин, то використовують осаджування у циліндрі або прямо у колбі, які поміщають у посудину з льодом. Тривалість осадження 15 – 20 хв залежно від розміру клітин і їх агрегатів. Невеликі агрегати з дрібними найбільш життєздатними клітинами осідають останніми. Після осадження супернатант відсмоктують.
Для найдрібніших і найстійкіших клітин (наприклад, моркви) допустимі швидкості заморожування 1 – 4 °С/хв, але для більших і вакуолізованих, до яких належить більшість рослинних клітин, що культивуються in vitro, рекомендується швидкість 0,5 °С/хв, а для самих великих агрегатів і апексів ще менші швидкості. Апарати програмного заморожування випускає Спеціальне конструкторське бюро при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України у Харкові.
Сьогодні створено універсальну програму заморожування, яка забезпечила успіх з 13 клітинними штамами 6 видів рослин і меристемами трьох видів. Основна відмінність цієї програми – це використання „затравки”, тобто примусової ініціації кристалізації. Затравка має бути при температурі на 1–2 °С (не більше) нижчій точки замерзання кріозахисного розчину. Для затравки ампули занурюють у рідкій азот на 0,5–1,0 сек (у камері заморожувача).
Після затравки доцільно стабілізувати температуру на тому ж рівні до кристалізації всього розчину в ампулі. Для цього достатньо 20 хв. Далі знижують температуру із заданою швидкістю до –30 0С, а потім зі швидкістю ≈ 9 °С/хв до –70 °С і швидко переносять ампули в рідкий азот. Саме при цій кінцевій температурі повільного заморожування отримують максимальне виживання рослинних клітин.
Тривалість зберігання у рідкому азоті не лімітована при умові, що ампули не виступають над його поверхнею, так як температура над нею швидко підвищується. Відтавання має бути як можна більш швидким. Для цього ампули струшують у воді з температурою 40 °С, іноді навіть 60 °С.
Відмивання від кріопротектора застосовують тільки у разі речовин, токсичних для даних клітин. Вміст ампули розбавляють у 3–4 заходи з 15-хвилинним інтервалами великим об’ємом холодного живильного середовища або 3–15 % сахарозою. Потім клітини просто відстоюють, а супернатант замінюють на живильне середовище, об’єм якого приблизно рівний вихідному об’єму суспензії.
Найпростіший і цілком задовільний спосіб оцінки життєздатності клітин після розморожування – фарбування вітальним барвником. Для цього змішують краплю суспензії і краплю 0,1 % феносафраніна або 0,25 % синього Еванса. Розглядати під мікроскопом можна відразу, забарвлення мертвих клітин стійке не менше 30 хв (живі клітини не забарвлені). При використанні флюоресцеюючого барвника флюоресцеіндіацетату, навпаки, не забарвлені мертві клітини, але у цьому випадку розглядати можна через 6 хвилин, забарвлення менш стабільне і потрібний люмінесцентний мікроскоп. В зв’язку з тим що основна маса клітин в основному зосереджена в агрегатах з числом клітин більше 10–15, де клітини маскують одна одну і порахувати їх неможливо або складно, то рекомендують при підрахунку агрегатів, вважати агрегат живим, якщо 1/2 і більше його клітин не пофарбовані, і мертвим якщо більше половини клітин пофарбовані. Інші способи оцінки мають свої переваги, але потребують більше часу і не підвищують точність. Кінцевим критерієм є чітке відновлення росту при рекультивуванні розморожених об’єктів. Для цього варто розподілити суспензію із однієї або двох–трьох ампул на поверхні агарового живильного середовища. Відновлення культур потребує від 2 до 6 тижнів.
Вивчення життєздатності клітин після кріоконсервування показало, що зберігання в рідкому азоті не впливає на виживання і відновлення клітинних культур після кріозбереження. Наприклад, життєздатність клітинних ліній діоскореї не змінилася після зберігання у рідкому азоті протягом 4,5 років (штам ДМ-0,5) і 6 років (штам Д-1). Клітини моркви відновили ріст після 12 років кріозбереження. Вже одержані рослини-регенеранти картоплі, моркви, гороху, суниць, томатів з меристем, які зберігались при наднизьких температурах. Проводяться дослідження з кріозбереження клітинних штамів-продуцентів економічно важливих речовин.