- •Предмет, завдання і методологія біотехнології рослин
- •Історія розвитку методу культури клітин, тканин та органів рослин
- •Організація і обладнання біотехнологічної лабораторії
- •Посуд, інструменти і матеріали
- •Миття посуду
- •Методи стерилізації посуду
- •Методи стерилізації інструментів
- •Контрольні запитання і завдання
- •Живлення культури тканин
- •Мінеральне живлення
- •Вуглеводневе живлення
- •Вітаміни
- •Стимулятори росту
- •Фітогормони
- •Рослинні екстракти
- •РН – середовища
- •Приготування живильних середовищ
- •Стерилізація живильних середовищ
- •Стерилізація рослинного матеріалу
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих органів і зародків
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих клітин і тканин
- •Культура калюсних тканин
- •Особливості калюсних клітин
- •Генетика калюсних клітин
- •Культура клітинних суспензій
- •Культивування ізольованих клітин
- •Методи оцінки результатів
- •Мікроклональне розмноження рослин
- •Методи мікроклонального розмноження рослин
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Кріоконсервація клітин рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Клітинна селекція
- •Спонтанні та індуковані мутанти
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура рослинних клітин і речовини вторинного синтезу
- •Фактори, які впливають на вихід продуктів
- •Компоненти середовища
- •Фізичні фактори
- •Селекція і відбір
- •Утворення вторинних речовин в культурах рослинних тканин
- •Глікозиди
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих протопластів і соматична гібридизація
- •Виділення і очистка ізольованих протопластів картоплі
- •Виділення протопластів із мезофілу листка
- •Виділення протопластів із культури клітин
- •Культивування ізольованих протопластів
- •Умови культивування протопластів
- •Злиття ізольованих протопластів
- •Селекція соматичних гібридів
- •Генетична трансформація
- •Вектори для генетичної трансформації рослин
- •Плазміди агробактерій як вектори для трансформації
- •Вектори на основі днк-вмісних вірусів рослин
- •Методи перенесення чужинних генів у рослини
- •Трансгени і екологія
- •Контрольні запитання і завдання
- •Практичний курс Приготування і стерилізація живильних середовищ
- •Таблиця 8
- •Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (мс)
- •Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (мс). Стерилізація середовища автоклавуванням
- •Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)
- •Стерилізація рослинного матеріалу Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування асептичних рослин
- •Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ
- •Робота 6. Стерилізація листків
- •Робота 7. Стерилізація меристем
- •Калюсна культура Робота 8. Отримання первинного калюсу із різних експлантатів асептичних рослин
- •Робота 9. Дослідження явища фізіологічної полярності
- •Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури
- •Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип
- •КлітиннА суспензіЯ Робота 12. Отримання клітинної суспензії з калюсної тканини
- •Мікроклональне розмноження рослин Робота 13. Мікроклональне розмноження рослин живцями
- •Робота 14. Стебловий органогенез із листкових дисків тютюну
- •Таблиця 15 Середовища для мікроклонального розмноження тютюну та моркви (1 л середовища)
- •Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну
- •Робота 16. Прямий ембріогенез
- •Хід роботи
- •Робота 17. Непрямий ембріогенез
- •Культура ізольованих протопластів вищих рослин Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин
- •Словник термінів
- •Список літератури
Стерилізація рослинного матеріалу
Поверхневі покриви усіх органів рослин звичайно забруднені спорами різних мікроорганізмів та грибів. Однак внутрішні тканини здорових рослин вважають стерильними, хоча і в них можуть знаходитись непатогенні бактерії. Особливо багаті на внутрішню інфекцію тканини тропічних і субтропічних рослин, які мають великі судини.
Основною умовою успішного отримання і вирощування калюсних і особливо суспензійних культур є стерилізація рослинних об’єктів, яка полягає у вбиванні грибних та бактеріальних спор на зовнішній поверхні без пошкодження внутрішніх тканин. Для цього використовують різні стерилізуючі речовини.
Вид стерилізуючої речовини, її концентрація і тривалість застосування залежать від густини і чутливості тканини, яка буде стерилізуватися. Правильний вибір стерилізуючої речовини полягає в тому, щоб вона згубно діяла на всі мікроорганізми і в той же час мінімально пошкоджувала тканини. Ще однією важливою умовою є те, що стерилізуюча речовина повинна легко видалятися із тканини промиванням дистильованою водою або розкладатися. Інакше відбувається отруєння тканин, що негативно впливає на утворення і ріст калюсу.
Звичайно, режим стерилізації встановлюють експериментально для кожного об’єкта. Проте існують загальні правила, яких варто дотримуватись.
Перед стерилізацією тканину очищають від залишків землі, засохлих листків, покривних лусок (бульби, коренеплоди, підземні пагони). Ретельно миють щіткою з милом у теплій проточній воді, потім промивають проточною водою (40–60 хв) і ополіскують дистилятом. Така попередня підготовка набагато зменшує контамінацію поверхневих тканин.
Листки, пагони трав’янистих рослин промивають теплою водою з милом, потім проточною водою (30 – 40 хв) і ополіскують дистилятом.
Як правило стерилізацію починають з занурення рослинного матеріалу в 70 % етанол: листки, бруньки на 10 – 20 секунд, насіння, бульби, корені – на 1 – 5 хв. Іноді достатньо поверхню пагонів, листків і великого насіння протерти ватою, змоченою спиртом (абсолютним).
Обробка тканин етанолом руйнує восковий наліт на листках, посилює дію (проникнення) стерилізуючих речовин.
Детергент додають для змочування поверхні: 65 – 70 % спирт діє як детергент і стерилізатор.
Найчастіше для поверхневої стерилізації рослинних тканин використовують сполуки, які містять активний хлор (гіпохлорит натрію, гіпохлорит кальцію, хлорамін), ртутні препарати (сулема, діацид) і окисники (перекис водню, перманганат калію), етиловий спирт, рідше – концентровану сірчану кислоту, препарати азотнокислого срібла та антибіотики. Ефективність стерилізації підвищується при додаванні на 1 л стерилізуючого агента 5-6 крапель Твін-80 або Твін-20.
Гіпохлорит натрію (NaClO) використовують для стерилізації насіння та рослиних тканин у концентрації 0,5 – 5 % впродовж 1 – 20 хв. Гіпохлорит натрію є клітинною отрутою. Тому після стерилізації NaClO рослинні тканини слід ретельно відмити стерильною дистильованою водою.
Гіпохлорит кальцію (Ca(ClO)2) менш токсичний для тканин рослин ніж гіпохлорит натрію. Ca(ClO)2 використовують для стерилізації бульб, пагонів, насіння, бруньок, зав’язей, квіток, плодів.
Для стерилізації менш забруднених об’єктів використовують розчин хлораміну у концентрації 0,2-6-10 % протягом 20-30 хв.
Розчини, які містять хлор, використовують одноразово відразу ж після приготування.
Стерилізуючі розчини, які містять ртуть використовують для стерилізації бульб, коренеплодів, насіння, пагонів деревних рослин. Найчастіше використовують 0,1 %-й розчин сулеми (HgCl2).
Перекис водню використовують в основному для стерилізації насіння у концентрації 10-30 % впродовж 6-20 хв. Перекис водню найменше пошкоджує рослинні тканини і після нього не потрібне тривале відмивання, бо він швидко розкладається.
Концентровану сірчану кислоту використовують для стерилізації (5 хв) насіння з щільною оболонкою або опушеного. Обробка насіння кислотою, крім стерилізації, сприяє швидшому його проростанню в результаті покращення водо- і повітропроникності насінних оболонок.
Деякі рослинні тканини (бульби, цибулини) мають внутрішню інфекцію (зараження), якої складно позбутися звичайними методами стерилізації. У цьому разі використовують антибіотики – стрептоміцин, ампіцилін, ністатін, які звільняють матеріал від бактеріальної та грибкової інфекції, але погано впливають на проліферацію калюсу і регенерацію рослин, тобто послаблюють життєздатність експлантата.
Техніка стерилізації. Стерилізацію проводять у стерильних хімічних стаканах, накритих чашками Петрі. Очищений і промитий рослинний матеріал у боксі на декілька секунд або 1-2 хв поміщають у стакан з 70 % спиртом, потім стерильним пінцетом виймають і переносять у стерилізуючий розчин (табл. 3), після якого відмивають у 3-5 порціях стерильної дистильованої води.
Таблиця 3
Час стерилізації різних рослинних об’єктів
Орган рослини |
Час стерилізації, хв | |
гіпохлорит натрію або кальцію |
сулема | |
Насіння |
20 |
10-20 |
Стебла деревних рослин |
15-30 |
20-30 |
Стебла трав’янистих рослин |
10-15 |
8-10 |
М’ясисті корені, бульби |
20-25 |
15-20 |
Кореневища |
20-30 |
20 |
Листкові пластинки |
3-5 |
5 |
Верхівкові і пазушні бруньки |
10-15 |
3-15 |
Тканини репродуктивних органів |
3-5 |
1-5 |
Якщо об’єкти спливають, то їх накривають стерильним ватним тампоном для кращого контакту із стерилізуючим розчином. Дрібне насіння, плоди, бруньки стерилізують у мішечках із марлі або цупкої тканини.