Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (мс). Стерилізація середовища автоклавуванням

Мета роботи: приготувати живильне середовище Мурасиге і Скуга (МС) і простерилізувати середовище автоклавуванням.

Матеріали і обладнання: маточні розчини макро- і мікро солей, Fe-хелату і вітамінів, мезо-інозит, сахароза, агар, 1 N HCl і 1N КОН, ваги, шпателі, магнітний змішувач, рН-метр, плитка, автоклав, стакан або колба об’ємом 1 л, мірні циліндри - 500 мл, 100 мл, мірні піпетки - 5 мл, 1 мл, ватні пробки або фольга.

ХІД РОБОТИ

Для приготування 1 л середовища Мурасиге і Скуга (МС) необхідно взяти:

Макро МС 100 мл

Мікро МС 1 мл

Fe-хелат 5 мл

В₁ 1 мг

В₆ 1 мг

РР 0,5 мг

мезо-інозит 100 мг

сахароза 30 г (3%)

агар 7 г

1. Для приготування 1 л середовища МС колбу або стакан (1 л) помістити на магнітний змішувач, налити 250-300 мл бідистиляту і додати точно відмірену кількість розчинів макро- і мікросолей, Fe-хелат, вітамінів і фітогормонів, якщо останні входять до складу середовища.

2. Зважити потрібну кількість мезо-інозиту, сахарози і органічних добавок, якщо вони входять до складу середовища. Кожну наважку розчинити у окремій порції бідистильованої води.

3. Довести рН до 5,6-5,8 за допомогою 1N КОН або 1N НСl.

4. Наважку агару помістити у термостійку колбу або стакан, залити холодною бідистильованою водою (300-400 мл), залишити на 20 хв. для набухання і нагріти, постійно помішуючи до повного розчинення агару.

При приготуванні рідкого середовища агар не додається.

5. Додати розчинений агар до розчину 1 і довести до потрібного об’єму бідистильованою водою. Розчин і воду підігріти.

6. Розлити тепле середовище у колби або пробірки і закрити ватними пробками або фольгою.

У колби наливаємо середовище до 1/2-2/3 об’єму.

7. Простерилізувати середовище в автоклаві при тиску 0,8-1 атм (температура 115-120⁰С ) 20-25 хв залежно від об’єму (табл. 2).

Після закінчення стерилізації середовища в автоклаві варто повільно зменшувати тиск в апараті і відкривати кришку тільки після того, як внутрішній тиск буде дорівнювати зовнішньому ( на манометрі стрілка буде на 0). Інакше, через різку зміну тиску може статися змочування середовищем пробок і навіть їх виштовхування.

Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)

Мета роботи: оволодіти навиками стерилізації середовищ через бактеріальні фільтри; навчитися збирати і стерилізувати фільтри.

Матеріали і обладнання: маточні розчини макро- і мікросолей, вітамінів, Fe-хелату, ваги, шпателі, сахароза, мезоінозит, рН-метр, фільтр Зейтца, колба Бунзена, автоклав, ламінар-бокс, насос Камовського, стерильні колби, закриті фольгою, пробірки, мірні піпетки.

ХІД РОБОТИ

1. Зібрати фільтр Зейтца.

1.1. Розгвинтити металевий корпус фільтра.

1.2. В нижню частину корпуса закласти металеву сітку, потім однакового діаметру з корпусом кільце з тонкої гуми, диск із фільтрувального паперу, ультрафільтр, другий диск фільтрувального паперу і гумове кільце.

Мембранний ультрафільтр має блискучу і матову поверхні, при зборці його слід класти матовою поверхнею в сторону сітки.

1.3. Накласти верхню частину корпуса і пригвинтити її до нижньої, але не повністю.

2. Зібраний фільтр Зейтца за допомогою гумової пробки вмонтувати в колбу Бунзена. На бічний відросток колби одягнути вакуумний шланг. Для запобігання забрудненню з повітря у шланг вставити з’єднану з насосом скляну трубку з ватним тампоном.

3. Зібраний і з’єднаний з колбою фільтр Зейтца загорнути в цупкий обгортковий папір або целофан.

4. Простерилізувати фільтр в автоклаві при 1 атм і 120⁰С 30 хв.

5. Після автоклавування гвинти, які з’єднують верхню і нижню частини корпуса, туго загвинтити і для забезпечення більшої герметичності залити місця з’єднання пробки з колбою і фільтром парафіном.

6. Приготувати 100 мл рідкого ( без агару )середовища МС ( робота 2 ).

7. Профільтрувати середовище з використанням вакууму (насос Камовського або водоструминний насос).

Фільтрат має повільно скапувати краплинами, якщо ж він стікає швидше, це може свідчити про порушення цілісності фільтра.

Після закінчення фільтрування слід повільно запускати повітря в колбу, інакше ватний тампон засмокчеться всередину і фільтрат буде інфіковано.

8. Послідуючі операції проводити у ламінар-боксі.

Підготувати ламінар-бокс до роботи.

9. Обпалити систему ватним тампоном, змоченим у спирті.

10. У полум’ї спиртівки акуратно від’єднати фільтр Зейтца від колби Бунзена.

11. Обпалити горло колби у полум’ї спиртівки.

12. Перелити фільтрат із колби у стерильну колбу, в якій він буде зберігатися.

13. Обпалити горло колби у полум’ї спиртівки і закрити стерильною фольгою.