Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури

Первинний калюс, що утворився на експлантатах через 4-6 тижнів, переносять на свіже живильне середовище - перевивають ( субкультивують ). Розмір трансплантата при культивуванні на агаровому середовищі коливається від 60 до 100 мг маси тканини на 30-40 мл живильного середовища.

Мета роботи: наростити калюсну тканину і отримати перевивну культуру.

Матеріали і обладнання: чашки Петрі з експлантатами, на яких утворився калюс, чашки Петрі зі стерильним середовищем для калюсу ( табл. 8 ), пінцети, скальпелі, стерильні чашки Петрі, спирт, спиртівка, ламінар-бокс, парафілм.

ХІД РОБОТИ

1. Експлантат з первинним калюсом перенести у стерильну чашку Петрі.

2. Притримуючи експлантат пінцетом, скальпелем зрізати калюс.

3. Скальпелем поділити калюсну тканину на рівні фрагменти, які перенести на свіже живильне середовище.

4. Підписати чашку Петрі і закрити парафілмом.

5. Чашки культивувати у термостаті при 25⁰+1⁰С.

6. Через 4-6 тижнів від нарослої калюсної тканини відділити шматочки агарового середовища, а калюс розділити на рівні фрагменти, які перенести на свіже живильне середовище для калюсу.

Для підтримання калюсної культури дану операцію необхідно проводити кожні 4-6 тижнів.

Період субкультивування встановлюють для кожної культури експериментально.

Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип

Мета роботи: візуально визначити тип калюсної тканини на середовищах з різним співвідношенням ауксин:цитокінін; визначити співвідношення ауксин:цитокінін, яке забезпечує максимальний приріст маси калюсної тканини.

Матеріали і обладнання: чашки Петрі з калюсом (картоплі, тютюну, сої, топінамбура тощо), маточні розчини макро- та мікросолей МС, Fe-хелату, вітамінів, 2,4-Д, кінетин, інозит, сахароза, агар, 1N KOH, пеніцилінові флакончики, фольга, мірний циліндр, мірні піпетки, ваги, рН-метр, автоклав, стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, спирт, спиртівка, хромовий ангідрид, пробірки, камера Фукс-Розенталя, мікроскоп.

ХІД РОБОТИ

Робота складається з кількох етапів.

Етап 1.

1. Приготувати 1л середовища МС з додаванням 3 мг/л 2,4-Д ( робота 2).

2. Розділити середовище на 10 частин по 100 мл і розлити по пронумерованих стаканчиках.

3. До середовища у кожний стаканчик додати відповідну кількість кінетину від 0,1 до 1 мг/л (0,1, 0,2, 0,3...1 мг/л).

4. Середовище розлити по пеніцилінових флакончиках (по 5 мл), закрити фольгою і проавтоклавувати.

Етап 2.

1. У боксі 4-6-ти тижневу калюсну тканину розділити на рівні фрагменти, які перенести на середовище у пеніцилінові флакончики.

20-30 експлантатів залишити і окремо зважити для встановлення середньої маси експлантата.

2. Флакончики з калюсом культивувати у термостаті при 25⁰+1⁰С.

3. Через 6 тижнів візуально визначити тип калюсу і кожний шматочок калюсу вийняти із флакончика, відокремити від нього агар і зважити.

4. Відносний приріст маси калюсної тканини визначити за формулою:

,

де ∆W - відносний приріст маси,

W₀ - початкова маса калюсу,

Wt - кінцева маса калюсу.

Результати записати у таблицю 14 і побудувати діаграму.

Таблиця 14

№ п/п	Вміст кінетину у середовищі (мг/л)	Середня вага калюсу, мг		Відносний приріст маси калюсу, %	Тип калюсу
		початкова	кінцева

Етап 3.

1. Приготувати 100 мл 7,5%-го розчину хромового ангідриду.

2. У 30 пробірок налити по 2 мл розчину хромової кислоти.

3. Із кожного варіанта досліду приготувати по 3 наважки калюсної тканини по 0,1 г, які помістити у пробірки з розчином для мацерації.

4. Пробірки помістити у термостат при 25⁰С на 24 год.

Час інкубації для кожної культури підбирають експериментально.

5. Перед підрахунком ретельно, але акуратно, струсити вміст пробірки, щоб вийшла рівномірна суспензія клітин. Якщо вона дуже густа, то її треба розвести водою (розведення враховують при перерахунку).

6. Піпеткою з широким кінчиком швидко нанести по краплі суспензії клітин на кожну сітку лічильної камери Фукс-Розенталя, закрити її склом і притерти його до бічних граней сіток до появи кілець Ньютона.

7. Провести підрахунок клітин у чотирьох великих квадратах, розташованих по діагоналях сітки лічильної камери (рис.3). Підраховувати в обох сітках.

8. Промити камеру, заповнити знову і провести повторний підрахунок.

Операцію повторювати 3 рази для кожної пробірки.

9. Кількість клітин в 1 г калюсної тканини обчислюють за формулою:

,

де N - кількість клітин в 1 г калюсної тканини; n - кількість клітин у одному великому квадраті; 0,2 - глибина камери Фукс-Розенталя; d - наважка калюсної тканини, яку взяли для підрахунку клітин (г); V - кінцевий об’єм суспензії клітин.

10. Побудувати гафік залежності кількості клітин в 1 г калюсної тканини від співвідношення 2,4-Д:кінетин. Зробити висновок про оптимальне співвідношення ауксин:цитокінін у середовищі для калюсу.