Виділення і очистка ізольованих протопластів картоплі

Як вихідний матеріал для виділення протопластів, як правило, використовують інтактні листки або калюсні і суспензійні культури. Виділення протопластів проводять за методом фільтрації–центрифугування (Рис. 5).

Виділення протопластів із мезофілу листка

Для виділення мезофільних протопластів використовують рослини певного віку, наприклад, при отриманні протопластів із листків тютюну беруть 50 – 60

Рис. 5. Етапи виділення і культивування протопластів.

добові рослини, із листків бобів – 14 – 18 добові. Ферментні розчини готуються безпосередньо перед використанням і стерилізуються через бактеріальний фільтр (1 % Cellulysin – целюлаза, 0,5 % Macerozyme – пектиназа).

1. Листки нарізають тонкими смужками (менше 1 мм) і кладуть на поверхню ферментного розчину. Ферментацію проводять у чашках Петрі або у колбочках об’ємом 50 мл. Оптимальну температуру і час інкубації необхідно підбирати для кожного конкретного випадку.

2. Тотальний препарат протопластів після інкубації у ферментному розчині фільтрують через нейлонову сітку (розмір пор – 50 – 100 мкм), щоб позбутися шматочків тканини і елементів провідної системи.

3. На поверхню ферментного розчину акуратно нашаровують сольове середовище W-5, до складу якого входять NaCl, CaCl₂, KCl і глюкоза.

4. Суспензію протопластів центрифугують при 100g 2 – 3 хв.

5. Протопласти, які флотували на межі ферментного розчину і середовища W-5, акуратно відбирають пастерівською піпеткою і переносять у центрифужну пробірку, у яку до 1 мл суспензії протопластів додають 8 – 10 мл сольового середовища W-5 і центрифугують при 80 – 100 g 3 хв.

6. Осад протопластів двічі відмивають у середовищі W-5 центрифугуванням.

Виділення протопластів із культури клітин

Оскільки клітини у суспензійній культурі мають потовщену клітинну стінку, що ускладнює її гідроліз ферментами і тому зменшується вихід протопластів, то для підвищення цього показника (виходу ізольованих протопластів) рекомендують пересаджувати клітинну суспензію на свіже живильне середовище кожні 2 – 3 доби.

Для виділення протопластів із суспензії її спочатку фільтрують, а потім клітини суспендують у ферментному розчині або змішують суспензію із ферментом у співвідношенні 1:1. Ферментна суміш: 1,5 % Onozuka (целюлаза), 0,5 % Macerozyme (пектиназа) і 0,2 % Cellulysin.

Суспензію рекомендують інкубувати на шейкері. Температуру і час необхідно підбирати індивідуально для кожного об’єкта.

Подальші операції аналогічні тим, які проводять при виділенні мезофільних протопластів.

Культивування ізольованих протопластів

Способи культивування ізольованих протопластів відповідають тим, що використовують для вирощування клітин. Протопласти культивують у рідкому і агаровому середовищах (табл.6).

Одним із прийомів культивування ізольованих протопластів у рідкому середовищі є метод рідких крапель. У цьому разі суспензію протопластів у вигляді крапель поміщають на рідке середовище в чашках Петрі. Метод забезпечує хороший газообмін. Однак при культивуванні цим способом ізольовані протопласти агрегуються у центрі кожної краплини, накопичуючись вони утворюють значні кількості фенольних та інших токсичних сполук, що заважає нормальному культивуванню протопластів.

Другий спосіб культивування ізольованих протопластів - агарова культура або метод плейтінга. У цьому випадку певний об’єм суспензії протопластів у рідкому живильному середовищі наливають у чашки Петрі, додають рівний

Таблиця 6

Склад (мг/л) середовищ для культивування протопластів

Компоненти середовища	Гамборга та Евелега	Мурасиге і Скуга	Нагате і Такебе	Шенка і Хільде-брандта
NH4NO3		1650	825
KNO3	2500	1900	950	2500
CaCl22H2O	150	440	220	200
MgSO47H2O	500	370	1233	500
NaH2PO4	150			300
(NH4)2SO4	134
KH2PO4		170	680
FeSO47H2O	27,25	27,85	27,8	27,85
Na2EDTA .2H2O	37,25	37,25	37,3	37,3
H3BO3	3	6,2	6,2	5
ZnSO47H2O	2	8,6	8,6	1
CuSO45H2O	0,025	0,025	0,025	0,2
CoCl26H2O	0,025	0,025	0,03	0,1
KI	0,75	0,83	0,83	1
Na2MoO42H2O	0,25	0,25	0,25	0,1
MnSO4H2O	10	22,3	22,3	10
Iнозит	100	100	100	100
PP	1			5
В1	10	1	1	5
В6	1	1		0,5
Ca-пантотенат	1	1		5
Кінетин		5		0,1
НОК		1	3
2,4-Д	2			1
Сахароза	20000	30000	10000	30000
Маніт			0,7 M
pH	5,5	5,5	5,8	5,6

об’єм того ж самого середовища, яке містить 1% агару. Температура не вища 45⁰С. Чашки Петрі заклеюють парафілмом і культивують перевернутими при температурі близько 28⁰С.

Протопласти фіксовані в одному положенні і фізично відокремлені один від одного. Основна перевага, цього способу культивування це можливість спостерігати для кожного конкретного протопласта всю послідовність розвитку – формування клітинної стінки, поділ клітин, ріст і розвиток рослини. Недолік полягає у можливому пошкодженні протопластів коли вони змішуються з агар-агаром.

Різновидністю агарової культури є сумісні культури. Цей спосіб використовується для ефективного культивування деяких протопластів. Протопласти, які відрізняються швидким ростом, змішують з протопластами, які важко культивувати. Вважають, що успішне культивування обумовлене речовинами, які виділяють протопласти, що швидко ростуть.