Умови культивування протопластів

Середовище. Основна вимога до середовищ полягає у тому, щоб у процесі культивування не відбувалося руйнування ізольованих протопластів, бо до утворення клітинної стінки протопласти – це дуже ніжні структури, і щоб воно було оптимальним для утворення клітинами колоній.

Як правило, середовище має складатися з осмотичного стабілізатора, неорганічних сполук, джерел вуглецю, вітамінів, джерел органічного азоту і фітогормонів. Як осмотичний стабілізатор можна використовувати маніт, сорбіт та їхні комбінації. Склад мінеральних солей відповідає складу мінеральних солей в середовищах для культивування клітин рослин. Можна міняти співвідношення амонійного та нітратного азоту залежно від потреб клітин, збільшувати концентрацію CaCl₂ для стабілізації клітинної стінки, що формується.

Як джерело вуглецю використовують глюкозу, сахарозу, їх суміш. Сахароза не завжди може бути придатним компонентом середовища для протопластів. У деяких випадках додають рибозу, ксилозу, фруктозу, манозу та інші цукри.

До складу вітамінів при культивуванні ізольованих протопластів мають входити тіамін HCl (В₁), піридоксин HCl (В₆) і нікотинова кислота (РР). При невеликій щільності висіву необхідно додавати й інші вітаміни.

Як джерела азоту до середовища додають амінокислоти, найчастіше використовують гідролізат казеїну, який є сумішшю амінокислот і додають його в тому разі, коли в середовищі недостатній вміст неорганічного азоту, а його концентрацію вже не можна збільшити.

Ауксини і цитокініни необхідні для клітинного ділення і подальшого розвитку рослинних клітин. Як правило використовують 2,4-Д, НОК, кінетин, БАП, зеатин. Оптимальні концентрації фітогормонів підбирають у кожному конкретному випадку.

Важливого значення при культивуванні ізольованих протопластів набувають і інші умови. Так, рН середовища має становити від 5,4 до 5,8.

Температура, при якій культивують ізольовані протопласти варіює в значній мірі залежно від виду. Так, для протопластів одного представника злаків – росички (Digitaria sanguinalis) оптимальною є температура 30 °С, а для пшениці 22 °С. Більшість ізольованих протопластів культивується при температурі 24 – 26 °С.

Що стосується інтенсивності світла, то у більшості випадків дослідники прийшли до висновку, що світло високої інтенсивності згубно впливає на ізольовані протопласти. Але оптимальні значення освітленості варіюють у широких межах. Так, люцерна утворює колонії у абсолютній темряві (100 – 700 Лк), а для протопластів Nemesia strumosa (немезія – норичникові) оптимальний ріст спостерігали при освітленості 80 000 Лк.

Суттєвим фактором культивування є щільність висіву протопластів. При дуже низькій щільності протопласти часто не діляться. З іншого боку, при дуже високій щільності труднощі виникають на пізніших стадіях, коли на ріст можуть впливати продукти обміну, що виділяються. Оптимальна щільність протопластів у культурі 10⁴ – 10⁶ пр/мл. Дещо компенсувати високу щільність висіву протопластів можна додавши до живильного середовища активоване вугілля.

У процесі культивування ізольовані протопласти регенерують нову клітинну стінку і перетворюються у звичайну клітину, яка культивується in vitro. Саме ця обставина робить ізольовані протопласти зручною моделлю для вивчення формування целюлозних мікрофібрил. Дрібні протопласти, отримані із меристематичної тканини, починають формувати стінку приблизно через 1,5 години після початку культивування і через добу клітинна стінка повністю покриває протопласти. Протопласти із дорослих листків мають більші розміри і регенерують стінку значно повільніше: через 4 години з’являються перші осередки новоутворення стінки, а через добу стінка ще не утворює суцільний покрив.

Спостереження за регенерацією клітинної стінки у протопластів скімії показали, що у цей період спостерігається сильне збільшення ендоплазматичного ретикулума. Припускають, що у шорстких ділянках ендоплазматичного ретикулума утворюються ферменти, які беруть участь у синтезі попередників целюлози.

У ході регенерації целюлозних компонентів клітинної стінки, можна виділити два періоди:

І^й період – синтез іде дуже повільно і приводить до утворення незначної кількості целюлози;

ІІ^й період – починається приблизно через 8 діб після культивування, і характеризується різким збільшенням (у 5 разів) швидкості синтезу целюлози.

Заново синтезована клітинна стінка не містить пектинові речовини.

Як правило, ізольовані протопласти більшості видів рослин через добу утворюють клітинну стінку, а через 2 – 3 доби відбувається перший поділ. Другий поділ відбувається на 7 – 8 добу, потім утворюється 8-клітинні колонії і на 21 – 30 добу культивування формуються багатоклітинні колонії.

При перенесенні їх на агарове середовище утворюється калюс, із якого можна отримати цілу рослину. Регенерація рослин відбувається або через ембріогенез, або через утворення калюсу з подальшою індукцією морфогенезу.