- •Предмет, завдання і методологія біотехнології рослин
- •Історія розвитку методу культури клітин, тканин та органів рослин
- •Організація і обладнання біотехнологічної лабораторії
- •Посуд, інструменти і матеріали
- •Миття посуду
- •Методи стерилізації посуду
- •Методи стерилізації інструментів
- •Контрольні запитання і завдання
- •Живлення культури тканин
- •Мінеральне живлення
- •Вуглеводневе живлення
- •Вітаміни
- •Стимулятори росту
- •Фітогормони
- •Рослинні екстракти
- •РН – середовища
- •Приготування живильних середовищ
- •Стерилізація живильних середовищ
- •Стерилізація рослинного матеріалу
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих органів і зародків
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих клітин і тканин
- •Культура калюсних тканин
- •Особливості калюсних клітин
- •Генетика калюсних клітин
- •Культура клітинних суспензій
- •Культивування ізольованих клітин
- •Методи оцінки результатів
- •Мікроклональне розмноження рослин
- •Методи мікроклонального розмноження рослин
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Кріоконсервація клітин рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Клітинна селекція
- •Спонтанні та індуковані мутанти
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура рослинних клітин і речовини вторинного синтезу
- •Фактори, які впливають на вихід продуктів
- •Компоненти середовища
- •Фізичні фактори
- •Селекція і відбір
- •Утворення вторинних речовин в культурах рослинних тканин
- •Глікозиди
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих протопластів і соматична гібридизація
- •Виділення і очистка ізольованих протопластів картоплі
- •Виділення протопластів із мезофілу листка
- •Виділення протопластів із культури клітин
- •Культивування ізольованих протопластів
- •Умови культивування протопластів
- •Злиття ізольованих протопластів
- •Селекція соматичних гібридів
- •Генетична трансформація
- •Вектори для генетичної трансформації рослин
- •Плазміди агробактерій як вектори для трансформації
- •Вектори на основі днк-вмісних вірусів рослин
- •Методи перенесення чужинних генів у рослини
- •Трансгени і екологія
- •Контрольні запитання і завдання
- •Практичний курс Приготування і стерилізація живильних середовищ
- •Таблиця 8
- •Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (мс)
- •Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (мс). Стерилізація середовища автоклавуванням
- •Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)
- •Стерилізація рослинного матеріалу Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування асептичних рослин
- •Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ
- •Робота 6. Стерилізація листків
- •Робота 7. Стерилізація меристем
- •Калюсна культура Робота 8. Отримання первинного калюсу із різних експлантатів асептичних рослин
- •Робота 9. Дослідження явища фізіологічної полярності
- •Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури
- •Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип
- •КлітиннА суспензіЯ Робота 12. Отримання клітинної суспензії з калюсної тканини
- •Мікроклональне розмноження рослин Робота 13. Мікроклональне розмноження рослин живцями
- •Робота 14. Стебловий органогенез із листкових дисків тютюну
- •Таблиця 15 Середовища для мікроклонального розмноження тютюну та моркви (1 л середовища)
- •Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну
- •Робота 16. Прямий ембріогенез
- •Хід роботи
- •Робота 17. Непрямий ембріогенез
- •Культура ізольованих протопластів вищих рослин Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин
- •Словник термінів
- •Список літератури
Спонтанні та індуковані мутанти
Як правило, для отримання мутантів використовують мутагени.
Мутагени можуть бути фізичними та хімічними. Серед хімічних мутагенів найчастіше використовуються етилметансульфонат (ЕМС), етилнітрозосечовина (НЕС) і нітрозометилсечовина (НМС) – всі викликають хромосомні перебудови. Як фізичні мутагени найчастіше використовують іонізуюче (рентгенівське та γ - промені) і УФ випромінення.
У багатьох випадках для отримання мутантів in vitro не обов’язково діяти на клітини мутагенами. Флік у 1983 р. підрахував, що із 124 мутантів, виділених через культуру тканин, 70 відібрані без попередньої мутагенної обробки. Частота виникнення різних спонтанних мутацій у рослинних клітин може варіювати від 10 -5 до 10 -8. Поява окремих фенотипних змін може бути вищою, якщо це обумовлено мутацією більш ніж одного гена.
Отриманню спонтанних мутантів надається перевага при селекції сільськогосподарських культур, коли небажані побічні мутації.
Частоту спонтанних і індукованих мутацій визначають як відношення числа мутантних клонів до кількості клонів, що вижили.
Одним із джерел спонтанних мутацій може бути сомаклональна мінливість, або сомаклональна варіабельність. Механізми цього явища ще цілком не з’ясовані.
Основними причинами виникнення сомаклональних варіантів перш за все є гетерогенність соматичних клітин вихідного матеріалу, генетична мінливість, яка індукується умовами культивування, а також генотип і вихідний експлантат.
У соматичних тканинах рослин нерідко присутні клітини з різною кількістю хромосом. Особливо часто це спостерігається у рослин, що розмножуються вегетативним шляхом – у картоплі. А культура тканин і клітин створює умови для прояву цієї гетерогенності. Причина гетерогенності – відхилення, аномальні мітози, які часто є результатом зміни умов вирощування, особливо при їх погіршенні (зниження або підвищення температури, засолення ґрунтів, великі дози мінеральних добрив).
Цитологічні дослідження свідчать, що варіабельність, яка індукується умовами культивування in vitro пов’язана з генетичними змінами, в першу чергу зі зміною кількості і структури хромосом. Показано, що при введенні клітин в культуру їх каріотип зазнає змін і через 1 – 2 покоління у суспензійній або калюсній культурі є клітини з іншою генетичною конституцією. Збереження стабільності кількості хромосом у клітинній культурі є дуже рідким виключенням і досягається в результаті ретельного підбору оптимальних умов культивування. Однак і в таких дослідах, показано, що у клітинній популяції є небагато клітин з іншим числом хромосом.
Для доказу того, що зміна кількості хромосом у клітинах, що культивуються обумовлена не лише гетерогенністю вихідної рослинної тканини, а і умовами культивування використовують клонування окремих клітин. Клон отриманий із однієї клітини при культивуванні in vitro набуває генетичної гетерогенності.
Частіше ніж зміна кількості хромосом у клітинах, що культивуються відбуваються аберації (перебудови) хромосом. У суспензійній культурі Haplopappus gracilis процент аберацій хромосом в анафазах через 61 день культивування становив 32 %. Були виявлені фрагменти хромосом, дицентровані хромосоми.
Тривалість культивування клітин in vitro теж сприяє підвищенню генетичного різноманіття сомаклонів.
Високий ступінь різноманіття сомаклональних варіантів залежить від вихідного генотипу, природи і стадії розвитку експлантата. Наприклад, у різних злаків ступінь мінливості серед сомаклонів може значно відрізнятися: у пшениці (2n=6x=42) із 192 досліджених рослин-регенерантів 29% були анеуплоїдами, у вівса (2n=6x=42) виявлені цитогенетичні зміни з такою ж частотою, а для кукурудзи частота виникнення анеуплоїдних рослин не перевищувала 2-3%. Утворення поліплоїдних і анеуплоїдних рослин спостерігається і у інших родів, наприклад, у картоплі. До речі частота появи нових варіантів у диких видів значно нижча, ніж у дигаплоїдних ліній культурної картоплі.
Тип вихідного експлантата також впливає на появу сомаклональних варіантів, які відрізняються кількісними і якісними ознаками. Для картоплі, наприклад, аномальні рослини отримані в 12% випадків при використанні первинним експлантатом мезофілу листка, а в разі використання пелюсток або осі суцвіть частота формування рослин з фенотипними відхиленнями від норми становила 50%.
Сомаклональні варіанти мають практичне використання в сільськогосподарському виробництві. Наприклад, отримані сомаклони картоплі сорту Зарево, які відрізняються високою урожайністю, підвищеною стійкістю до хвороб, вищим вмістом у бульбах білка і крохмалю. Для рослин тютюну через калюсну культуру отримані сомаклони, стійкі до вірусу тютюнової мозаїки, а для цукрового очерету отримано новий сорт, який характеризується високою урожайністю і підвищеною стійкістю до хвороб, зокрема до хвороби Fiji.
За допомогою методів клітинної селекції отримано мутанти стійкі до антибіотиків, до амінокислот та їх аналогів, до гербіцидів, до стресових факторів та до хвороб. Проведення селекції на клітинному рівні дозволяє створювати нові форми рослин у 2-4 рази швидше, ніж традиційні способи селекції. Сьогодні метод культури тканин широко використовують в селекції не тільки кормових і технічних культур, але і декоративних і лікарських рослин.