Злиття ізольованих протопластів

Ізольовані протопласти за той час поки вони не утворили клітинну стінку, можуть зливатися між собою. Злиття протопластів може бути спонтанним. Це явище, причиною якого може бути збереження плазмодесм між сусідніми клітинами, відбувається дуже рідко. Тривала інкубація або зависока концентрація ферментної суміші різко зменшують спонтанне злиття. А тому для стимуляції злиття протопластів запропоновано ряд методів.

Перше повідомлення про злиття ізольованих протопластів зроблене Kюстер у 1909 році. Для індукції злиття протопластів він випробував кілька речовин і прийшов до висновку, що найефективнішим є нітрат кальцію, хоча частота злиття протопластів була низькою.

Протягом останніх 20 років, в якості індукторів злиття ізольованих протопластів випробували: NaNo₃, штучну морську воду, лізоцим, желатину, високе рН – висока концентрація Са⁺⁺, антитіла, рослинний лектин конвалін, ПЕГ, полівініловий спирт, позитивно заряджені синтетичні фосфоліпіди та інші речовини.

На даний час найпоширенішою є методика, коли для індукції злиття протопластів використовують розчини з високим рН (9 – 11) і концентрацією іонів Са⁺⁺ (100 – 300 мМ). При цьому протопласти попередньо аглютинують за допомогою розчину ПЕГ. Використовуючи цю методику можливо стимулювати до злиття 10 – 50 % протопластів.

Зімерман з співробітниками у 1981 році розробили фізичний метод злиття протопластів, у якому як індуктор злиття використовують імпульси електричного струму. Протопласти поміщають в камеру, де створюється неоднорідне, змінне електричне поле. За цих умов на електродах формуються агрегати, які складаються з 2 – 3 протопластів, або між електродами формуються “ланцюжки” із 5 – 6 протопластів (це явище відомо як діелектрофорез). До цієї системи додатково додається одиничний імпульс, який викликає злиття протопластів в агрегаті. Всі фізичні параметри підбираються індивідуально. Злиття відбувається при питомій електропровідності середовища нижчій 10^-4 См/см. Цю умову задовольняє 0,5 М розчин маніту, який відноситься до неелектролітів: його питома електропровідність 1,4·10^-5 См/см.

Злиття, що індукується електричним струмом, має таке пояснення: імпульс короткої тривалості викликає руйнування мембран протопластів, що стикуються. Навколо “дірки” можливий обмін ліпідними молекулами, утворення ліпідних містків, що призводить до злиття мембран. Це енергетично більш вигідний стан, ніж існування двох пошкоджених мембран.

Ефективність електрозлиття залежить від віку рослини, походження протопластів, їх розмірів, довжини “ланцюжка”, щільності суспензії протопластів, тривалості дії поодинокого імпульсу.

Для автоматизації процедури електрозлиття ізольованих протопластів розроблено і вже застосовується ряд установок. Наприклад, Electro Cell Manipulator 200 (США), або установка, створена НВО “Корна” (Росія). Ці установки складаються з генератора напруги, генератора поодиноких імпульсів, підсилювача потужності, кювет з платиновими електродами.

Отже, у всіх методах злиття протопластів на першому етапі відбувається їх агрегація.

Аналіз експериментальних матеріалів, що стосується структури і властивостей мембран при впливі індукторів злиття, показує, що в умовах високого рН, під дією високих концентрацій Са²⁺ у рослинних протопластів відбувається збільшення плинності мембран. ПЕГ не викликає збільшення плинності мембран, а сприяє агрегації протопластів.

Розробка способів індукції злиття протопластів разом з розвитком техніки культивування клітин in vitro, що дає можливість отримання ізольованих протопластів, їх культивування, утворення калюсу, а в подальшому цілої рослини, сформували новий і перспективний метод гібридизації рослин – парасексуальну, або соматичну гібридизацію.

Соматична гібридизація – гібридизація рослин в обхід статевого схрещування, при якій як батьківські клітини використовують ізольовані протопласти соматичних клітин або клітини, що культивуються in vitro.

Цей метод дозволяє схрещувати філогенетично віддалені види рослин, які неможливо схрестити звичайним статевим шляхом, отримувати асиметричні гібриди. На відміну від статевого схрещування, де відбувається одностороннє виключення протоплазми, при соматичній гібридизації в утвореному гібриді обидва партнери мають відносно рівний цитоплазматичний статус. Злиття протопластів сприяє об’єднанню двох різних цитоплазм. У більшості випадків злиття ізольованих протопластів призводить до утворення або гібрида, або цибрида (цитоплазматичного гібрида) (Рис.6).

Цибридна клітина містить цитоплазму обох партнерів, а ядро – одного. Утворення рослин з гібридною цитоплазмою і органелами обох партнерів, але з ядром лише одного виду можливе у тому разі, якщо після злиття протопластів не відбувається з’єднання ядер і одне ядро дегенерує. Утворення цибридів можливе і в тому випадку, коли один із протопластів позбавлений ядра або воно інактивоване шляхом опромінення.

Рис. 6. Схеми успадкування батьківських ядерних (кружок) і позаядерних (овал) детермінант при соматичній і статевій гібридизаціях.

Цибридизація дозволяє ввести цитоплазматичні гени, які несуть ознаки ЦЧС (цитоплазматичної чоловічої стерильності), стійкості до деяких гербіцидів і патогенів.

Перший нестатевий міжвидовий гібрид вищих рослин отриманий в 1972 р. шляхом злиття ізольованих протопластів двох видів тютюну: Nicotiana glauca i N. Langsdorfii. Одним із найцікавіших соматичних гібридів є pomato – гібрид картоплі й томату, одержаний у 1978 р. І хоча цей гібрид поки що стерильний, а діаметр його плодів не перевищує 3 мм, саме його існування привертає увагу до методу прогресивних селекціонерів.

На сьогодні методами соматичної гібридизації отримані внутрішньовидові (дурману, петунії та ін.), міжвидові (петунії, моркви, дурману, картоплі), міжродові (томати + картопля; арабідопсис + турнепс; дурман + красавка) та міжродинні гібриди (горох + тютюн; цибуля + тютюн). Однак у багатьох випадках гібридні рослини, отримані таким способом, в певній мірі, ненормальні. Наприклад соматичний гібрид між арабідопсисом і турнепсом, який є рослиною-монстром. Аномалії, що виникають, є результатом хромосомної незбалансованості.

Особливий інтерес становлять міжцарственні гібриди, які отримані від злиття протопластів рослинних і тваринних клітин. Описані гібриди між протопластами моркви і людини, тютюну і людини та інші.