Культура ізольованих протопластів вищих рослин Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин

Мета роботи: оволодіти методикою виділення і культивування протопластів із мезофілу листка; отримати ізольовані протопласти із мезофілу листка рослин картоплі.

Матеріали і обладнання: асептичні рослини картоплі, ферментні препарати - Cellulysin, Macerase, Driselase, глюкоза, сахароза, ксилоза, манітол, CaCl₂·2H₂O, NaCl, KCl, NH₄NO₃, KNO₃, MgSO₄·7H₂O, KH₂PO₄, NH₄Cl, FeSO₄·7H₂O, Na₂ЕДТА·2H₂O, H₃BO₃, MnCl₂·4H₂O, ZnSO₄·7H₂O, CuSO₄·5H₂O, CoSO₄·7H₂O, KI, Na₂MoO₄·2H₂O, мезоінозит, гліцин, нікотинова кислота, фолієва кислота, біотин, аденін сульфат, гідролізат казеїну, тіамін, піридоксин, ІОК, НОК, 2,4-Д, БАП, зеатин, 1N KOH, агар, стакани на 200 мл, мірні циліндри, мірні піпетки, пастерівські піпетки, чашки Петрі діаметром 60 мм і 100 мм, колби Ерленмейера на 250 мл і 50 мл, колбочки зі скляними лійками і нейлоновими фільтрами (діаметр пор 50-100 мкм), центрифужні пробірки з гумовими пробками, шприц з насадкою з фільтрами “Millipore” з діаметром пор 0,22 мкм або 0,45 мкм, стерильний фільтр Зейтца, ваги, шпателі, пінцети, скальпелі, лезо у держаку, магнітний змішувач, рН-метр, настільна центрифуга, інвертований мікроскоп, плитка, автоклав, ламінар-бокс, спиртівка, вата, фольга, спирт, парафілм.

ХІД РОБОТИ

Робота складається з кількох етапів.

Етап 1. Підготовка до досліду.

1. Приготувати середовище виділення протопластів SI: 0,5 М розчин сахарози з 5 мМ CaCl₂.

2. Приготувати середовище W-5 для відмивання протопластів (табл. 16).

3.Приготувати середовище W-S-S для культивування мезофільних протопластів картоплі ( табл. 16).

Для культивування мезофільних протопластів тютюну використовують середовище К-3 ( табл. 16 ).

4. Приготувати середовища ST-1, ST-2 і ST-3 ( табл. 16).

Для регенерації рослин тютюну використовують середовище RMOP (табл. 16).

5. Простерилізувати середовища.

6. Простерилізувати посуд для досліду:

Таблиця 16

Середовища для виділення і культивування протопластів картоплі і тютюну та регенерації з них рослин (мг/л)

Компоненти	W-5	K-3	W-S-S	ST-1	ST-2	ST-3	RMOP
NaCl	9000
NH4NO3		250	1280			1650	1650
KNO3		2500		1900	1900	1900	1900
CaCl22H2O	18400	900	600	440	440	440	440
MgSO47H2O		250	300	370	370	370	370
KH2PO4			170	170	170	170	170
KCl	800		300
Na2PO4H2O		150
(NH4)2SO4		134
NH4Cl				267	267
Fe-хелат		250	250	250	250	250	250
H3BO3		3	6	6	6	6	6
ZnSO47H2O		2	10	10	10	8.6	10
CuSO45H2O		0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025
CoCl26H2O		0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025
KI		0.75	0.83	0.83	0.83	0.83	0.83
Na2MoO42H2O		0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
MnSO4H2O		10	10
MnSO44H2O				22.3	22.3	22.3	22.3
Мезоінозит		100	100	100	100	100	100
Гліцин				2	2	2
PP		1	1	5	5	5
Фолієва кислота				0.5	0.5	0.5
Біотин				0.05	0.05	0.05
Аденін сульфат				40	80	40
Гідролізат казеїну			500	300	100
В1		10	10	0.5	0.5	1	10
В6		1	1	0.5	0.5	0.5	1
ІОК					0.1		0.1
НОК		0.2	2	1
2,4-Д		1	0.2
БАП		0.2	0.5	0.5			1
Зеатин					0.5
Сахароза		10000		2500	2500	25000	10000
Глюкоза	1000		72000
Ксилоза			250
Манітол		72800		54600	36400
Агар				1%	1%	0.7%	0.7%
pH	5,7

^- середовище стерилізувати фільтруванням

- у сушильній шафі: чашки Петрі діаметром 60 мм і 100 мм, колби Ерленмейера на 50 мл закриті фольгою, пастерівські піпетки,

- у автоклаві: колбочки зі скляними лійками з нейлоновими фільтрами, центрифужні пробірки з гумовими пробками, шприц з насадкою для фільтрування, фільтр Зейтца.

Етап 2. Приготування ферментних розчинів

і ферментація тканин.

1. Приготувати ферментну суміш, яка містить 1% Cellulysin, 0,5% Macerase і 0,1% Driselase в середовищі виділення.

Для ферментації мезофілу тютюну використовують суміш, яка містить 0,5% Cellulase, 0,5% Macerase і 0,2% Driselase.

Калюсну тканину картоплі і тютюну ферментують у суміші, яка містить 1-2% Cellulase, 0,5-1% Macerase, 0,5-1% Driselase. Для ферментації варто брати свіжий і м’який калюс, який розсипається у ферментній суміші.

2. Відцентрифугувати суміш 10-15 хв при 2 тис. об/хв для осадження нерозчинних частинок.

3. Довести 1N КОН рН ферментної суміші до 5,6.

4. У боксі за допомогою шприца з насадкою з фільтром “Millipore” профільтрувати суміш у стерильну колбу Ерленмейера.

5. Розлити стерильний ферментний розчин по 7-10 мл в колби Ерленмейера на 50 мл.

Ферментні розчини краще готувати безпосередньо перед дослідом або за добу до досліду.

6. У боксі дістати із пробірки 4-тижневі рослини картоплі і помістити їх у стерильні чашки Петрі.

7. Притримуючи рослини пінцетом, скальпелем обрізати листки.

8. Акуратно притримуючи листки пінцетом, щоб не пошкодити мезофіл, лезом , закріпленим у держаку, нарізати їх тонкими ( до 1 мм завширшки) смужками.

9. Листкові смужки помістити на поверхню ферментної суміші у колби Ерленмейера, щоб тканина покривала всю поверхню суміші (  1 г тканини на 10 мл ферментної суміші).

10. Колби з рослинним матеріалом помістити у термостат на 16 год при температурі 26⁰С.

Оптимальну температуру і час інкубації необхідно підбирати для кожного конкретного випадку.

Етап 3. Виділення та очищення ізольованих протопластів.

1. Після інкубації додати у колби з рослинним матеріалом такий же об’єм середовища виділення.

2. Тотальний препарат протопластів профільтрувати через нейлонову сітку, щоб позбутися немацерованих шматочків тканини і елементів провідної системи.

3. Фільтрат стерильною піпеткою перенести у центрифужні пробірки (  4/5 об’єму пробірки).

4. На фільтрат по стінці пробірки акуратно за допомогою піпетки нашарувати середовище W-5 (  1/5 об’єму). Закрити пробірки і відцентрифугувати при 100 g 3 хв.

5. Поки йде центрифугування, у чисті центрифужні пробірки налити середовище W-5 (  4/5 об’єму ).

6. З центрифугату акуратно відібрати стерильною піпеткою верхній шар, в якому містяться протопласти, які флотували на межі середовищ, і перенести у центрифужні пробірки з середовищем W-5 і відцентрифугувати при 80 g 3 хв.

7. Піпеткою акуратно відібрати надосадову рідину.

8. Відмивання протопластів проводимо ще раз.

Етап 4. Культивування ізольованих протопластів

і регенерація рослин.

1. У стерильні чашки Петрі ( діаметр 60 мм ) налити 2-3 мл середовища для культивування ізольованих протопластів W-S-S.

2. 2-3 краплі густої суспензії протопластів у середовищі W-5 піпеткою перенести в чашки Петрі з середовищем W-S-S.

3. Культивувати протопласти на розсіяному світлі при температурі 25⁰+1⁰С. Щодоби спостерігати за розвитком протопластів під інвертованим мікроскопом.

4. Після утворення клітинних колоній ( через 8-10 діб ) до суспензії клітин додати свіже живильне середовище W-S-S і в міру розведення суспензії частину колоній з середовищем перенести в нові чашки Петрі.

5. Колонії, які досягли розмірів 0,5-1 мм перенести на агарове середовище ST-1 для формування мікрокалюсів. Культивувати на світлі 3-4 клк при 16-годинному фотоперіоді.

6. Через 10-15 днів яскраво-зелені колонії діаметром 1-3 мм перенести на середовище ST-2 для органогенезу і культивувати при 25⁰С, 16-годинному фотоперіоді і освітленні 3-4 клк 25-30 днів.Часто для регенерації рослин необхідно повторно пересаджувати колонії на свіже середовище ST-2.

7. Сформовані пагони висотою 3-10 мм відділити від калюсу і перенести на безгормональне середовище ST-3 для вкорінення.

Оформлення роботи: замалювати ізольовані протопласти і клітинні колонії, описати калюси і рослини-регенеранти.