- •Предмет, завдання і методологія біотехнології рослин
- •Історія розвитку методу культури клітин, тканин та органів рослин
- •Організація і обладнання біотехнологічної лабораторії
- •Посуд, інструменти і матеріали
- •Миття посуду
- •Методи стерилізації посуду
- •Методи стерилізації інструментів
- •Контрольні запитання і завдання
- •Живлення культури тканин
- •Мінеральне живлення
- •Вуглеводневе живлення
- •Вітаміни
- •Стимулятори росту
- •Фітогормони
- •Рослинні екстракти
- •РН – середовища
- •Приготування живильних середовищ
- •Стерилізація живильних середовищ
- •Стерилізація рослинного матеріалу
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих органів і зародків
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих клітин і тканин
- •Культура калюсних тканин
- •Особливості калюсних клітин
- •Генетика калюсних клітин
- •Культура клітинних суспензій
- •Культивування ізольованих клітин
- •Методи оцінки результатів
- •Мікроклональне розмноження рослин
- •Методи мікроклонального розмноження рослин
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Кріоконсервація клітин рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Клітинна селекція
- •Спонтанні та індуковані мутанти
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура рослинних клітин і речовини вторинного синтезу
- •Фактори, які впливають на вихід продуктів
- •Компоненти середовища
- •Фізичні фактори
- •Селекція і відбір
- •Утворення вторинних речовин в культурах рослинних тканин
- •Глікозиди
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих протопластів і соматична гібридизація
- •Виділення і очистка ізольованих протопластів картоплі
- •Виділення протопластів із мезофілу листка
- •Виділення протопластів із культури клітин
- •Культивування ізольованих протопластів
- •Умови культивування протопластів
- •Злиття ізольованих протопластів
- •Селекція соматичних гібридів
- •Генетична трансформація
- •Вектори для генетичної трансформації рослин
- •Плазміди агробактерій як вектори для трансформації
- •Вектори на основі днк-вмісних вірусів рослин
- •Методи перенесення чужинних генів у рослини
- •Трансгени і екологія
- •Контрольні запитання і завдання
- •Практичний курс Приготування і стерилізація живильних середовищ
- •Таблиця 8
- •Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (мс)
- •Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (мс). Стерилізація середовища автоклавуванням
- •Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)
- •Стерилізація рослинного матеріалу Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування асептичних рослин
- •Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ
- •Робота 6. Стерилізація листків
- •Робота 7. Стерилізація меристем
- •Калюсна культура Робота 8. Отримання первинного калюсу із різних експлантатів асептичних рослин
- •Робота 9. Дослідження явища фізіологічної полярності
- •Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури
- •Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип
- •КлітиннА суспензіЯ Робота 12. Отримання клітинної суспензії з калюсної тканини
- •Мікроклональне розмноження рослин Робота 13. Мікроклональне розмноження рослин живцями
- •Робота 14. Стебловий органогенез із листкових дисків тютюну
- •Таблиця 15 Середовища для мікроклонального розмноження тютюну та моркви (1 л середовища)
- •Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну
- •Робота 16. Прямий ембріогенез
- •Хід роботи
- •Робота 17. Непрямий ембріогенез
- •Культура ізольованих протопластів вищих рослин Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин
- •Словник термінів
- •Список літератури
Контрольні запитання і завдання
1. Що таке кріозбереження та яке його значення?
2. Назвіть особливості рослинних клітин, які ускладнюють розробку універсальних методів їх кріозбереження.
3. Що таке кріопротектори?
4. Назвіть найефективніші кріопротектори.
5. Які швидкості заморожування рослинних об’єктів?
6. Яка тривалість зберігання у рідкому азоті заморожених рослинних об’єктів?
7. Назвіть способи оцінки життєздатності рослинних клітин після розморожування.
Клітинна селекція
Клітинна селекція – один із важливих напрямків в біотехнології рослин. Відбір клітинних ліній і рослин з цінними спадковими ознаками відбувається на рівні клітин, що культивуються in vitro в селективних умовах. Основною перевагою клітинної селекції є можливість маніпулювати з мільйонами клітин, проводити направлену селекцію в чашках Петрі і регенерацію рослин. Отримання рослин із відібраних у селективних умовах клітин можливе завдяки унікальній властивості рослинних клітин – тотипотентності.
Для проведення клітинної селекції використовують такі прийоми:
пряма (позитивна) селекція, при якій виживає певний мутантний тип клітин;
непряма (негативна) селекція, яка базується на вибірковій загибелі клітин дикого типу, які діляться, і виживанні метаболічно неактивних клітин, але потребує додаткової ідентифікації у них мутаційних змін;
ступінчата, або поступова селекція, при якій концентрацію токсичної речовини підвищують поступово. Як правило селекцію починають з концентрації, яка викликає загибель 50 % клітин;
тотальна селекція, при якій індивідуально тестуються усі клітинні клони;
візуальна селекція і неселективний відбір, коли варіантна лінія може бути ідентифікована серед всієї популяції клітин візуально або при використанні біохімічних методів (тонкошарова або рідинна хроматографія, радіоімунний аналіз, мікроспектрофотометрія та інші).
Із перерахованих вище прийомів клітинної селекції найчастіше для відбору різних мутантів використовують пряму селекцію. Цей метод використовують для виділення мутантів стійкості, наприклад до гербіцидів, антибіотиків, токсинів, важких металів тощо.
При селекції цих мутантів у кожному випадку необхідно визначати селективні концентрації токсичних речовин. У більшості випадків вміст токсичних речовин не повинен бути значно вищим того, що інгібує ріст тканин. У цілому схему прямої селекції через ізольовані протопласти можна представити так:
1. виділення протопластів;
2. обробка мутагеном (не обов’язкова);
3. культивування в неселективних умовах (3 – 5 поділів ≈ 10 – 14 днів);
4. культивування на селективних середовищах;
5. культивування на регенераційних середовищах (краще з селективним агентом);
6. егенерація рослин і їх розмноження (тести на стійкість, біохімічний аналіз);
7. висадка рослин у ґрунт;
8. тестування на стійкість насіння.
Для проведення робіт по клітинній селекції в умовах in vitro як вихідний матеріал можуть бути використані калюсні і суспензійні культури, ізольовані протопласти, органи: пилок, насіння, зародки, листки, меристеми, сегменти стебла, пагони.
Вибір об’єкта залежить від міри розробленості методик і технологій стосовно різних видів рослин, а також від кінцевих цілей дослідження.
Калюсна тканина – це найбільш доступний матеріал, який часто використовують для селекції in vitro. Використовують, як правило, свіжовиділену тканину або ту, що культивується, але не втратила регенераційну здатність. Саме через культуру калюсної тканини вперше виділені лінії тютюну стійкі до стрептоміцину, токсинстійкі мутанти кукурудзи.
Однак при роботі з калюсними тканинами є ряд суттєвих недоліків:
- відносно повільний ріст тканини;
- нерівноцінний для всіх тканин ефект мутагенів, а також селективних речовин;
- ідентифікація окремих стійких клітин може ускладнюватися їх маскуванням не мутантними клітинами;
- ріст стійких клітин може пригнічуватися мертвими клітинами;
- поряд зі стійкими можуть виживати чутливі клітини, які контактують з мутантними;
- культивованим тканинам характерна генетична нестабільність і втрата регенераційної здатності.
Проте не зважаючи на ці недоліки використання калюсних тканин, для багатьох видів рослин ефективні технології та способи культивування одиночних клітин ще не розроблені, і даний вихідний матеріал для селекції мутантів in vitro залишається найбільш придатним.
Велику кількість робіт по культивуванню калюсу, з метою отримання нового селекційного матеріалу, проведено на пшениці, ячмені, рисі, сорго, картоплі, томатах, люцерні і дуже рідко на деревних. Уже досягнуто перші позитивні результати по отриманню рослин пшениці, рису, картоплі, стійких до NaCl або Na2SO4. Шляхом додавання в живильне середовище токсичних аналогів амінокислот отримані клітини, а з них рослини моркви, які синтезують у 20 разів більше метіоніну, в 30 разів – триптофану, в 5 разів – лізину. Отже, використання калюсної культури в селекційних цілях відкриває величезні можливості у створенні нових форм рослин, які несуть цінні ознаки, необхідні для людини.