МУСІЄНКО М.М.

ПАНЮТА О.О.

БІОТЕХНОЛОГІЯ РОСЛИН

Рекомендовано Міністерством освіти і науки України

як навчальний посібник для студентів біологічних спеціальностей

вищих навчальних закладів

Київ – 2005

УДК 581.085:573.086.83:577.21

ББК 28.5я73

М91

Мусієнко М.М., Панюта О.О.

Біотехнологія рослин. Навчальний посібник. – К.: Видавничо-поліграфічний центр «Київський університет», 2005. – 114 с.

Висвітлено сучасні положення та методи біотехнології рослин. Наведено основні етапи історії дисципліни, особливості організації біотехнологічної лабораторії, відомості про живильні середовища та методи стерилізації рослинного матеріалу. Розглянуто питання мікроклонального розмноження рослин, клітинної селекції, кріозбереження рослин, одержання біологічно активних речовин, клітинної та генетичної інженерії. Наведено визначення найуживаніших в біотехнології рослин термінів.

Для студентів біологічних спеціальностей, викладачів, аспірантів, спеціалістів у галузі біотехнології, клітинної біології, фізіології рослин.

Рецензенти:

Я.Б. Блюм, д-р біол. наук, членкор НАН України;

О.Л. Кляченко, канд. біол. наук, доцент.

УДК 581.085:573.086.83:577.21

ББК 28.5я73

Гриф надано Міністерством освіти і науки України

(лист №14/18.2-1415 від 23.06.2004)

ISBN 966-594-662-5

ЗМІСТ

ТЕОРЕТИЧНИЙ КУРС
ПРЕДМЕТ, ЗАВДАННЯ І МЕТОДОЛОГІЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ РОСЛИН	5
ІСТОРІЯ РОЗВИТКУ МЕТОДУ КУЛЬТУРИ КЛІТИН, ТКАНИН ТА ОРГАНІВ РОСЛИН	7
ОРГАНІЗАЦІЯ І ОБЛАДНАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНОЇ ЛАБОРАТОРІЇ	9
ЖИВЛЕННЯ КУЛЬТУРИ ТКАНИН	13
АГАР	20
рН–СЕРЕДОВИЩА	20
ПРИГОТУВАННЯ ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ	21
СТЕРИЛІЗАЦІЯ ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ	22
СТЕРИЛІЗАЦІЯ РОСЛИННОГО МАТЕРІАЛУ	22
КУЛЬТУРА ІЗОЛЬОВАНИХ ОРГАНІВ І ЗАРОДКІВ	26
КУЛЬТУРА ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН І ТКАНИН	32
КУЛЬТУРА КАЛЮСНИХ ТКАНИН	34
КУЛЬТУРА КЛІТИННИХ СУСПЕНЗІЙ	38
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН	43
КРІОКОНСЕРВАЦІЯ КЛІТИН РОСЛИН	50
КЛІТИННА СЕЛЕКЦІЯ	55
КУЛЬТУРА РОСЛИННИХ КЛІТИН І РЕЧОВИНИ ВТОРИННОГО СИНТЕЗУ	59
КУЛЬТУРА ІЗОЛЬОВАНИХ ПРОТОПЛАСТІВ І СОМАТИЧНА ГІБРИДИЗАЦІЯ	64
ВИДІЛЕННЯ І ОЧИСТКА ІЗОЛЬОВАНИХ ПРОТОПЛАСТІВ КАРТОПЛІ	66
КУЛЬТИВУВАННЯ ІЗОЛЬОВАНИХ ПРОТОПЛАСТІВ	68
ЗЛИТТЯ ІЗОЛЬОВАНИХ ПРОТОПЛАСТІВ	71
СЕЛЕКЦІЯ СОМАТИЧНИХ ГІБРИДІВ	74
ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ	75
ВЕКТОРИ ДЛЯ ГЕНЕТИЧНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ РОСЛИН	77
МЕТОДИ ПЕРЕНЕСЕННЯ ЧУЖИННИХ ГЕНІВ У РОСЛИНИ	80
ТРАНСГЕНИ І ЕКОЛОГІЯ	84
ПРАКТИЧНИЙ КУРС
Приготування і стерилізація живильних середовищ	86
Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (МС)	87
Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (МС). Стерилізація середовища автоклавуванням	88
Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)	88
Стерилізація рослинного матеріалу	89
Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування асептичних рослин	89
Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ	91
Робота 6. Стерилізація листків	92
Робота 7. Стерилізація меристем	93
КАЛЮСНА КУЛЬТУРА	94
Робота 8. Отримання первинного калюсу із різних експлантатів асептичних рослин	94
Робота 9. Дослідження явища фізіологічної полярності	95
Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури	96
Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип	97
КлітиннА суспензіЯ	98
Робота 12. Отримання клітинної суспензії з калюсної тканини	98
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН	99
Робота 13. Мікроклональне розмноження рослин живцями	99
Робота 14. Стебловий органогенез із листкових дисків тютюну	99
Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну	100
Робота 16. Прямий ембріогенез	101
Робота 17. Непрямий ембріогенез	102
культура ізольованих протопластів вищих рослин	103
Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин	103
СЛОВНИК ТЕРМІНІВ	107
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ	110

Предмет, завдання і методологія біотехнології рослин

За останні 50 років площі земель, які використовуються у сільському господарстві залишились практично без змін, тоді як населення Землі зросло більше ніж у двічі. Забезпечення зрослої кількості населення продуктами харчування відбувалося у ці роки за рахунок поліпшення існуючих та створення нових високопродуктивних, стійких до біотичних і абіотичних факторів сортів рослин, порід тварин, корисних штамів мікроорганізмів. Важливу роль у вирішенні цих питань відіграє біотехнологія і особливо сучасна біотехнологія.

Біотехнологія – напрямок сучасної науки і техніки, основним завданням якого є використання живих організмів і біологічних процесів у виробництві. Термін “біотехнологія” походить від грецьких слів “bios” – життя, “techne” – майструвати, “logos” – вчення. Отже, це науковий напрямок, який поєднує можливості біології і техніки, коли біологія стає основою численних технологій.

Широкого поширення термін “біотехнологія” набув у середині 70^х років ХХ ст., хоча такі галузі біотехнології як хлібопечення, виноробство, пивоваріння, сироваріння, які базуються на використанні мікроорганізмів, відомі з давніх часів.

Сьогодні до складу біотехнології входять промислова мікробіологія, технічна біохімія, генетична інженерія, клітинна інженерія. Сучасна біотехнологія характеризується використанням біологічних методів для боротьби з забрудненням довкілля, захисту рослин від шкідників та хвороб, виробництва цінних біологічно активних речовин (антибіотиків, ферментів, гормональних препаратів тощо).

Сфера використання біотехнологічних процесів постійно розширюється, особливо у сільському господарстві, в охороні здоров’я (сюди можна віднести медицину, фармакологію, охорону навколишнього середовища), харчовій промисловості (харчові та кормові добавки).

Одним із важливих завдань, які має вирішити біотехнологія є пошук природно відновлювальних джерел енергії за рахунок фотосинтезу.

Провідною ідеєю сільськогосподарської біотехнології є отримання повноцінних харчових продуктів безпосередньо із рослинної сировини, без участі тварин. Очікують вирощування повноцінних кормів (багатих на білок, лізин) безпосередньо у процесі фотосинтезу. Можливі шляхи вирішення цієї проблеми це:

1) створення нових азотфіксуючих систем на основі соматичних гібридів між найбільш перспективними сортами рослин і азотфіксуючими рослинами або азотфіксуючими бактеріями (це будуть не соматичні гібриди, а азотфіксуючі симбіотичні асоціації);

2) введення в рослини генів, які забезпечують фіксацію азоту;

3) зміна структурних генів запасних білків за допомогою мутагенезу, щоб включити нові кодони для дефіцитних амінокислот (додавши додаткові кодони або замінивши деякі існуючі на корисніші з точки зору поживності);

4) генетична трансформація.

Не менш важливим напрямком біотехнологічних досліджень є отримання препаратів, які використовуються в охороні здоров’я. За допомогою сучасних біотехнологічних методів отримано понад 70 білкових біологічно активних речовин, у тому числі гормонів, білків крові, імунорегуляторів та імуномедіаторів. Створені сучасні принципи одержання вакцин; розробляються принципово нові методи діагностики та лікування інфекційних, онкологічних та інших захворювань.

Тут слід звернути увагу на те, що добре відомо: дріжджі, „харчуючись” вуглеводнями нафти, синтезують кормовий білок, за участю мікроорганізмів отримують ферменти, фармацевтичні препарати, вітаміни тощо. А те що фізіологічно активні речовини, які містяться в женьшені, раувольфії, маці

снодійному та інших культурах, можна виділяти не лише із відповідних рослин, але й із їхніх клітин, які вирощують на штучних живильних середовищах в умовах in vitro, залишається поки що мало відомим фактом для широкого загалу.

Перспективним є вилучення хімічних елементів із руд та гірських порід під впливом мікроорганізмів або їхніх метаболітів. Целюлозна та паперова індустрія також потребують допомоги біотехнології: так встановлено, що біологічна обробка деревини покращує механічну якість паперу і зменшує витрати енергії на виробництво.

Продемонструвати значення біотехнології у сучасному житті можна на прикладі Японії. Виявилося, що із 113 опитаних компаній у 30 з них (26 %) уже ведуть дослідження з біотехнології, а 55 (49 %) - планують взяти в них участь у найближчий час. Досягнення біотехнології планується використовувати для виявлення або створення мікроорганізмів, які можуть бути використані для запобігання забрудненню навколишнього середовища і збагачення корисних копалин.

Біотехнологію прийнято поділяти на традиційну, або класичну і нетрадиційну, або сучасну.

Традиційні біотехнології, які існують тисячоліттями використовують для отримання необхідних людині продуктів мікроорганізми, організми тварин та рослин.

Об’єктами дослідження нетрадиційної біотехнології, розвиток якої розпочався наприкінці ХІХ століття, стали тканини і клітини вищих багатоклітинних організмів, а також мікроорганізми, створені методами генної інженерії. Вищим досягненням сучасної біотехнології є генетична трансформація – перенесення чужорідних генів та інших носіїв спадковості у клітини рослин, тварин і мікроорганізмів, отримання трансгенних організмів з новими або покращеними властивостями і ознаками. Саме цей напрямок біотехнології дозволить вирішити докорінні завдання селекції біологічних об’єктів на стійкість, високу продуктивність і якість продукції. Уже сьогодні у багатьох лабораторіях світу, у тому числі і в Україні, за допомогою методів генетичної трансформації створені принципово нові трансгенні рослини, тварини і мікроорганізми, які отримали комерційне визнання.

Лауреат Нобелівської премії Норман Борлауг вважає, що лише нові біотехнології можуть врятувати світ від голоду та екологічних катастроф. І суттєва роль у цьому належить біотехнології рослин.

Біотехнологія рослин – це сукупність технічних прийомів для модифікації, покращення, створення та розмноження рослинних організмів, одержання з них корисних речовин.

Вирощування і маніпуляції з клітинами, тканинами і органами рослин поза організмом на штучних живильних середовищах у строго контрольованих умовах дозволяє:

- отримувати результати незалежно від клімату, сезону, ґрунтових умов;

- вивчати такі складні процеси як ріст, клітинна диференціація і розвиток рослинного організму, метаболізм і його регуляція у клітинах і тканинах цілої рослини;

- проводити швидке розмноження у дуже великих кількостях;

- отримувати безвірусний рослинний матеріал;

- створювати принципово нові технології для промисловості і сільського господарства;

- скоротити селекційний процес у 2, а той і 3 рази.