Етапи мікроклонального розмноження рослин

Процес мікроклонального розмноження складається із ряду послідовних операцій, кожна з яких має свою специфіку.

Першою операцією або етапом є вибір експлантатів і введення їх в культуру. Вихідним матеріалом для мікроклонального розмноження можуть бути верхівкові і пазушні меристеми стебла, молоді листки, елементи суцвіття і квітки, цибулин і бульбоцибулин. Ідеальним матеріалом для отримання чисельних пагонів є апікальні і пазушні бруньки здорових і активноростучих рослин.

На цій стадії визначальну роль відіграє стерилізація рослинного матеріалу, бо живильні середовища є чудовим субстратом для розвитку грибної і бактеріальної мікрофлори. Деякі дослідники використовують так званий „тест на інфікованість експлантатів сапрофітною мікрофлорою”, при якому експлантати спочатку поміщають на середовища без дефіцитних і дорогих складових. Протягом 7 – 10 днів відбувається вибраковування інфікованих експлантатів, а „чисті” поміщаються на середовище певного складу для подальшого культивування. У більшості випадків для мікроклонального розмноження рослин in vitro використовують різні модифікації середовища Мурасиге і Скуга.

Другим етапом є процес мікророзмноження, який відбувається за однією з приведених моделей. На цьому етапі важливу роль можуть відігравати такі фактори, як сортові і видові особливості, будова і розмір експлантата, його походження, склад живильного середовища і фізичні умови культивування.

Відомо, що здатність рослини до розмноження, як і будь-яка інша ознака генетично детермінована, чим пояснюється різна поведінка рослин різних видів у культурі ізольованих тканин і органів. І на сьогодні не завжди вдається створити для будь-якого генотипу умови, які індукують процеси регенерації або проліферації пагонів. Наприклад, суниця може розмножуватися за будь-якою моделлю мікроклонування, а ефективного розмноження обліпихи не вдалося досягти жодним із шляхів, хоча при традиційних методах розмноження вона прекрасно живцюється. У різних сортів у межах виду рослин здатність до розмноження теж варіює.

Для успішного проведення робіт з регенерації рослин суттєве значення має вибір експлантата. Краще всього використовувати матеріал, вилучений із здорових, сильних рослин. Вибір експлантата залежить від виду, стану рослини-донора (фази її розвитку), сезону року. Значення має навіть положення експлантата на рослині. Так, верхівки пагонів, взяті з верхніх гілок дерева, мають більшу швидкість розмноження, ніж верхівки з нижніх. Більшість експлантатів добре вводяться в культуру у фазу активного росту донорської рослини, але є рослини, експлантати з яких утворюють пагони лише в стані спокою. Незрілі, молоді органи мають кращі морфогенні потенції, ніж зрілі, старіючі тканини і органи.

Розмір експлантата є важливим фактором прояву регенераційної здатності. У цілому відмічено, що використання експлантатів більшого розміру, які містять меристематичні зони, швидше приводить до успішного результату, ніж використання меристематичних верхівок. Проте взяття експлантата великого розміру спряжене з посиленою небезпекою інфікування.

У середовище для культивування експлантатів доцільно додавати антиоксиданти (цистин, меркаптоетанол, глутатіон тощо), які пригнічують активність деяких ферментів і запобігають загибелі експлантатів.

Внесення у середовище активованого вугілля забезпечує зв’язування і виведення низки токсичних речовин, які є у середовищі, серед них і деякі фенольні сполуки, які утворюються у процесі вирощування.

На перших етапах вирощування експлантата важливим є успішне проходження процесів дедиференціації і вступу клітин у ембріональний стан, початок активних клітинних поділів, утворення калюсу, гісто- та органогенез. В цей час особливу увагу слід приділити оптимізації умов живлення. Для цього до складу живильного середовища додають крім мінеральних солей і вуглеводів амінокислоти, вітаміни, ауксини, цитокініни, гібереліни. У подальшому, для індукції росту стебла і формування кореня, склад живильного середовища спрощується. Із фітогормонів додають лише ауксин.

Третім етапом мікроклонування є індукція коренеутворення у пагонів, що досягається додаванням у живильне середовище ауксинів. Але наявність ауксинових аналогів у середовищі бажана лише на початкових етапах формування кореневих зачатків. Для подальшого росту закладених коренів наявність у живильному середовищі ауксинів навіть шкідлива. Тому часто для стимуляції ризогенезу використовують обробку пагонів стерильними розчинами препаратів. Цей метод набув широкого поширення для деревних і чагарникових рослин.

Останній етап процесу мікроклонального розмноження – адаптація пробірочних рослин до нестерильних умов є найбільш відповідальним і його недооцінка може загубити всю проведену, кропітку роботу.

Розроблена ціла система адаптацій пробірочних рослин до звичайних умов. Спочатку укорінені пробірочні рослини пересаджують на рідке розбавлене живильне середовище. Потім, приблизно через тиждень, такі рослини пересаджують у проавтоклавований ґрунт, а для підтримки високої вологості накривають скляними посудинами. Через 7 – 10 днів накриття знімають, витримують ще приблизно тиждень у спеціалізованих боксах і тільки після цього висаджують у теплицю.

Щоб ефективність мікроклонального розмноження була високою, необхідно на всіх етапах цього процесу підтримувати оптимальні умови вирощування: освітлення, температуру, відносну вологість повітря. У зв’язку з цим для кожної культури розробляють конкретну методику мікроклонального розмноження.

Хоча вартість рослин, одержаних методом культури ізольованих тканин і органів, поки-що більша, ніж рослин, що розмножуються традиційними способами, мікроклональне розмноження вважається перспективним способом вегетативного розмноження, бо дозволяє отримувати оздоровлений посадковий матеріал, скорочувати селекційний процес і проводити роботи впродовж цілого року, економлячи площі для вирощування рослин.