- •Предмет, завдання і методологія біотехнології рослин
- •Історія розвитку методу культури клітин, тканин та органів рослин
- •Організація і обладнання біотехнологічної лабораторії
- •Посуд, інструменти і матеріали
- •Миття посуду
- •Методи стерилізації посуду
- •Методи стерилізації інструментів
- •Контрольні запитання і завдання
- •Живлення культури тканин
- •Мінеральне живлення
- •Вуглеводневе живлення
- •Вітаміни
- •Стимулятори росту
- •Фітогормони
- •Рослинні екстракти
- •РН – середовища
- •Приготування живильних середовищ
- •Стерилізація живильних середовищ
- •Стерилізація рослинного матеріалу
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих органів і зародків
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих клітин і тканин
- •Культура калюсних тканин
- •Особливості калюсних клітин
- •Генетика калюсних клітин
- •Культура клітинних суспензій
- •Культивування ізольованих клітин
- •Методи оцінки результатів
- •Мікроклональне розмноження рослин
- •Методи мікроклонального розмноження рослин
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Кріоконсервація клітин рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Клітинна селекція
- •Спонтанні та індуковані мутанти
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура рослинних клітин і речовини вторинного синтезу
- •Фактори, які впливають на вихід продуктів
- •Компоненти середовища
- •Фізичні фактори
- •Селекція і відбір
- •Утворення вторинних речовин в культурах рослинних тканин
- •Глікозиди
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих протопластів і соматична гібридизація
- •Виділення і очистка ізольованих протопластів картоплі
- •Виділення протопластів із мезофілу листка
- •Виділення протопластів із культури клітин
- •Культивування ізольованих протопластів
- •Умови культивування протопластів
- •Злиття ізольованих протопластів
- •Селекція соматичних гібридів
- •Генетична трансформація
- •Вектори для генетичної трансформації рослин
- •Плазміди агробактерій як вектори для трансформації
- •Вектори на основі днк-вмісних вірусів рослин
- •Методи перенесення чужинних генів у рослини
- •Трансгени і екологія
- •Контрольні запитання і завдання
- •Практичний курс Приготування і стерилізація живильних середовищ
- •Таблиця 8
- •Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (мс)
- •Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (мс). Стерилізація середовища автоклавуванням
- •Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)
- •Стерилізація рослинного матеріалу Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування асептичних рослин
- •Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ
- •Робота 6. Стерилізація листків
- •Робота 7. Стерилізація меристем
- •Калюсна культура Робота 8. Отримання первинного калюсу із різних експлантатів асептичних рослин
- •Робота 9. Дослідження явища фізіологічної полярності
- •Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури
- •Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип
- •КлітиннА суспензіЯ Робота 12. Отримання клітинної суспензії з калюсної тканини
- •Мікроклональне розмноження рослин Робота 13. Мікроклональне розмноження рослин живцями
- •Робота 14. Стебловий органогенез із листкових дисків тютюну
- •Таблиця 15 Середовища для мікроклонального розмноження тютюну та моркви (1 л середовища)
- •Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну
- •Робота 16. Прямий ембріогенез
- •Хід роботи
- •Робота 17. Непрямий ембріогенез
- •Культура ізольованих протопластів вищих рослин Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин
- •Словник термінів
- •Список літератури
Культура калюсних тканин
Калюс – тканина, що виникла в результаті неорганізованої проліферації клітин органів рослин.
У природі калюс утворюється в результаті дедиференціації паренхімних клітин у відповідь на поранення. Утворення і ріст калюсу регулюються ауксинами і цитокінінами. За допомогою цих речовин можна індукувати утворення калюсу у тих тканин рослини, які не утворюють його у відповідь на поранення. Існують нові уявлення, згідно яких не ауксини і цитокініни, а полісахариди та якісь інші індуктори викликають ділення клітин, в результаті якого утворюється калюс.
Перехід клітини in vitro із диференційованого стану до дедиференціації і активних клітинних поділів обумовлений зміною активності генів (епігенетичною мінливістю). Активування одних генів і репресування інших приводить до зміни білкового складу клітин. В калюсних клітинах з’являються специфічні білки і водночас зникають або зменшуються в кількості білки, які характерні для фотосинтезуючих клітин листка.
При переході дедиференційованої клітини до неорганізованого анархічного розмноження, яке приводить до утворення калюсної тканини, в клітинах відбуваються біохімічні і цитологічні зміни. Дедиференціація починається з використання запасних речовин і руйнування спеціалізованих клітинних органел. Через 6-12 год після індукції дедиференціації клітинна стінка розпушується і розбухає, збільшується кількість вільних рибосом, зростає кількість елементів апарату Гольджі, збільшуються розміри і кількість ядерець. Всі ці зміни передують початку поділів, які починаються через 48-72 год.
Після індукування утворення калюсу в асептичних умовах його відділяють і поміщають на поверхню агарового живильного середовища. В результаті цього отримують стерильну калюсну культуру або тканину, яка є основним типом рослинної тканини, що культивується. Вперше калюс був отриманий із кореня моркви Р.Готре у 1938 році.
На сьогодні калюсні культури індукуються практично із будь-якого органа і тканини рослин (листків, стебел, коренів, квітконосів, частин квітки) і навіть таких спеціалізованих тканин рослин, як ендосперм насіння або мікроспори ізольовані із пиляків. Однак простота цього процесу залежить від виду рослини і тканини. Здатність утворювати калюс в умовах in vitro у молодих, ювенільних, рослин вища, ніж у зрілих. У випадку спеціалізованих тканин, наприклад ендосперму, утворення і ріст калюсу залежать від віку насіння. Як правило, калюс погано утворюється на експлантатах старших 8-11 діб після запилення. Відрізки стебла деревних рослин звичайно є поганими експлантатами для отримання калюсу.
Варто зазначити, що для успішної ініціації первинного калюсу в живильне середовище часто необхідно додавати антиоксиданти (глютатіон – 5 мг/л, діетилдитіокарбамат – 5, цистеїн – 5, аскорбінову кислоту – 5, полівінілпіролідон – 250-500 мг/л та інші), які будуть інгібувати ферменти, що окислюють феноли. Продукти окислення фенолів токсичні і пригнічують поділ клітин експлантата.
При отриманні первинного калюсу експлантати краще культивувати на кількох середовищах з різним співвідношенням ауксинів:цитокінінів (табл. 4). Успіх отримання калюсу у значній мірі залежить від підбору регуляторів росту, індукторів клітинного поділу.
Із ауксинів найчастіше використовують 2,4–Д або ІОК, яка має меншу активність. Для індукування калюсогенезу співвідношення ауксинів до цитокінінів у живильному середовищі повинно бути 10:1.
Для отримання калюсу клітини спеціалізованих тканин при поміщенні на живильне середовище повинні дедиференціюватися. У більшості випадків клітини переходять до спеціалізації із фази G1, яка передує S-фазі – фазі синтезу ДНК, рідше із фази G2. Досить часто експлантат, який використовують для отримання калюсу, містить тканини, клітини яких по різному диференційовані. Різне тканинне походження первинних калюсних клітин є однією з причин гетерогенності калюсної тканини, так як деякі функціональні особливості диференційованих клітин передаються у ряді клітинних поколінь, як стійкі модифікації. Однорідність вихідної тканини має особливе значення для злаків.
У дводольних рослин калюси легко утворюються на експлантатах різних органів: із насіння, що проростає в асептичних умовах, сегментів стебла і коренів, ізольованих фрагментів паренхіми бульб, ізольованої серцевини стебла, із листка, органів квітки, зародків, плодів і т.д.
Для отримання калюсу голонасінних доцільно використовувати, як вихідний матеріал, бруньки, які ростуть, стерильні проростки, фрагменти флоеми. Калюси злаків отримують із зародків, мезокотилів, коренів або відрізків основи стебла. Основна проблема отримання калюсу злаків пов’язана із складністю виділення із цих рослин експлантату, який складається із однорідної тканини і має оптимальний, достатній розмір. Перша калюсна культура злакових отримана із ендосперму кукурудзи у 1949 році.
На сьогодні розроблені умови отримання калюсу ряду злакових культур. Так, калюс жита отримали із ізольованого кореня, калюс ячменю – із зародка, а суспензійну культуру – із відрізків кореня проростків, калюс риса – із вузлів стебла, відрізків коренів, пагонів, вівса – із насіння, що проростає, пшениці – із сім’ядольних вузлів і зародка.
Основною особливістю середовищ для калюсогенезу у злаків і подальшого культивування калюсу є високий вміст ауксинів, найчастіше 2,4–Д (до 10 мг/л). ІОК звичайно використовують у вищій концентрації, ніж її синтетичний аналог.
Таблиця 4
Склад середовищ для вирощування калюсних тканин рослин
Компоненти середовища |
Основне середовище, мг/л | ||||
Гамборга та Евелега |
Мурасиге і Скуга |
Ніча та Ніч |
Шенка і Хільде-брандта |
Уайта | |
NH4H2PO4 |
|
|
|
300 |
|
NH4NO3 |
|
1650 |
720 |
|
|
KNO3 |
2500 |
1900 |
950 |
2500 |
80 |
CaCl22H2O |
150 |
440 |
166 |
200 |
|
Ca(NO3)2 безводний |
|
|
|
|
208,50 |
MgSO47H2O |
250 |
370 |
185 |
400 |
360 |
KH2PO4 |
|
170 |
68 |
|
|
KCl |
|
|
|
|
65 |
NaH2PO42H2O |
169,6 |
|
|
|
18,7 |
(NH4)2SO4 |
134 |
|
|
|
|
Na2SO4 |
|
|
|
|
200 |
FeSO47H2O |
28,0 |
27,8 |
27,8 |
15,0 |
|
Na2EDTA.2H2O |
37,3 |
37,3 |
37,3 |
20,0 |
|
H3BO3 |
3,0 |
6,2 |
10,0 |
5,0 |
1,5 |
ZnSO47H2O |
2,0 |
8,6 |
10,0 |
1,0 |
3,0 |
CuSO45H2O |
0,025 |
0,025 |
0,025 |
0,2 |
0,001 |
CoCl26H2O |
0,025 |
0,025 |
|
0,1 |
|
KI |
0,75 |
0,83 |
|
1,0 |
0,75 |
Na2MoO42H2O |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,1 |
0,0025 |
MnSO44H2O |
13,2 |
22,3 |
25,0 |
13,2 |
7,0 |
Мезоінозит |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
1000,0 |
|
Гліцин |
|
2,0 |
2,0 |
|
3,0 |
PP |
1,0 |
0,50 |
5,0 |
5,0 |
0,5 |
Фолієва кислота |
|
|
0,5 |
|
|
Біотин |
|
|
0,05 |
|
|
В1 |
10,0 |
0,10 |
0,5 |
5,0 |
0,1 |
В6 |
1,0 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,1 |
ІОК |
|
0,2 |
|
|
|
2,4-Д |
2,0 |
|
|
0,5 |
|
Кінетин |
|
0,2 |
|
|
|
Сахароза |
20000 |
30000 |
20000 |
30000 |
20000 |
Агар |
7000 |
8000 |
7000 |
6000 |
7000 |
pH |
5,6-5,8 |
Оптимальна концентрація ІОК для злаків досягає 100 мг/л. Виключенням є калюс ендосперму кукурудзи, який росте на середовищі без ауксинів, так як здатний їх синтезувати.
Процес калюсоутворення залежить від розмірів експлантата – звичайно це 5–10 мм3. Для багатьох експлантатів обов’язково дотримуватись фізіологічної полярності.
Калюси можна вирощувати дуже довго. Для цього необхідно кожні 3-4 тижні пересаджувати частину утворених клітин на свіже живильне середовище. “Найстарішим” вважають штам клітин, одержаний з коренеплоду моркви Роже Готре ще у 1938 році, який і сьогодні вирощують у багатьох лабораторіях світу.
У циклі вирощування калюсні клітини після ряду поділів проходять звичайний для рослинної клітини онтогенез, вони переходять до росту розтягуванням, потім диференціюються як зрілі калюсні клітини і нарешті відмирають.
Калюсна тканина представляє аморфну масу тонкостінних паренхімних клітин. Колір маси може бути білим, жовтуватим, зеленим, червоним.
Залежно від походження і умов вирощування калюсні тканини бувають:
1) пухкими, сильно оводненими, розсипчастими;
2) середньої щільності, або компактними із меристематичними зонами;
3) щільними.
Консистенція калюсу залежить, в значній мірі, від складу середовища: на середовищах з ауксинами, особливо з 2,4–Д, калюси стають пухкішими. Із пухких калюсів дуже легко отримати суспензійну культуру при поміщенні їх у рідке середовище. Із компактних калюсів можна отримати пухкі, але не навпаки. Найбільша здатність до морфогенезу характерна для компактних калюсів, які повільно ростуть.
Пухкі і щільні калюси відрізняються анатомічно: щільні калюси менш диференційовані, містять багато вакуолізованих клітин, які щільно упаковані. Крім цього у щільних калюсів загальна кількість полісахаридів клітинної стінки вища, але вміст целюлози порівнюючи з пектиновими речовинами і геміцелюлозами занижений.
Калюсні тканини використовують для збереження у ростучому стані колекцій різних штамів, ліній, мутантів, із них отримують клітинні суспензії, які культивують в рідкому живильному середовищі, для регенерації рослин.