Культивування ізольованих клітин

Для генетичних і фізіологічних досліджень, а також для практичного використання в клітинній селекції використовують ізольовані клітини. Отримання клону-потомства одиночної клітини допомагає з’ясувати причини генетичної неоднорідності калюсних клітин, оскільки спостереження в цьому випадку проводяться на тканині, яку отримали не з гетерогенного експлантата, а з однієї клітини. Ізольовані клітини також використовують як модель для вивчення взаємовідношень між клітиною і оточуючим середовищем, клітинами рослини-хазяїна і різними патогенними мікроорганізмами тощо.

Отримання одноклітинних клонів рослин складається з двох етапів:

1. виділення одиночних життєздатних клітин;

2. створення сприятливих умов для їх поділу і росту.

Для виділення життєздатних культур використовують такі методи:

1. вирощування калюсної маси і отримання із неї суспензії;

2. слабо агреговані суспензії;

3. виділення окремих клітин із тканин цілої рослини.

Отримання клітин із суспензійних культур пов’язане з меншим ризиком пошкодження порівняно з виділенням безпосередньо із органів рослини. Для отримання одноклітинної фракції суспензійної культури іноді достатньо простого відстоювання у колбі протягом 15-30 хв. При цьому крупні агрегати осідають на дно колби, а надосадова фракція містить тільки одинокі клітини або дрібні агрегати. Якщо при відстоюванні не вдається отримати одноклітинну фракцію, то застосовують ферменти для мацерації, центрифугування в градієнті сахарози або фільтрування через сита (нейлонові або металеві).

Труднощі культивування одиночних клітин пов’язані з тим, що окрема клітина не ділиться в тих умовах, в яких добре росте калюсна тканина. Для того, щоб змусити одиночні клітини ділитися, розроблені спеціальні методи:

1. метод культури “няньки”;

2. метод мікрокультури або висячих крапель;

3. метод плейтінга.

Сюди можна віднести і культуру ізольованих протопластів, яку буде розглянуто далі.

Метод культури “няньки” запропонував Джонсон у 1960 році. Функцію “няньки”, яка стимулює поділ одиночної клітини, виконують шматочки калюсної тканини, відокремлені від неї фільтрувальним папером. У присутності “няньки” одиночна клітина ділиться і дає індивідуальну колонію клітин – клон (Рис. 2).

Метод мікрокультури базується на використанні дуже малих об’ємів багатого живильного середовища і являє собою культивування одиночних клітин в мікрокраплі в чашці Купрака об’ємом 20 мл. Метод запропонував

Рис.2. Метод культури “няньки” для вирощування культури із одиночної клітини.

академік Глєба Ю.Ю. У мікрокраплях зручно спостерігати за отриманням і діленням клітин при соматичній гібридизації.

Метод плейтінга передбачає змішування клітин суспензії з розплавленим та охолодженим до 35°–40° С середовищем і розлив тонким шаром (1 мм) у чашки Петрі. Цей метод був розроблений Бергманом у 1960 році. Цей метод використовують для отримання одноклітинних клонів та оцінки життєздатності клітин.

Використання культури “няньки”, мінімального об’єму середовища, в якому культивується окрема клітина, пов’язані з феноменом, який називають

“дія фактора кондиціонування”. Незважаючи на численні спроби визначити хімічну природу речовин (або речовини), які індукують ділення одиночної клітини, і механізм дії фактора кондиціонування, ця проблема залишається не вирішеною. Дослідження показали, що цей фактор хімічної природи і включає низькомолекулярні речовини (~700 Д).