Робота 16. Прямий ембріогенез

Мета роботи: отримати соматичні ембріоїди шляхом прямого ембріогенезу і проростити з них рослини моркви.

Матеріали і обладнання: 70%-й розчин спирту, стаканчики із стерильною дистильованою водою, концентрований розчин “Білизни”, стаканчик для стерилізуючого розчину, мірний циліндр, насіння моркви, чашки Петрі з середовищем для рослин МС, колби Ерленмейера з рідким середовищем МКР-3 (табл. 15 ), чашки Петрі зі стерильним фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, марля, пінцети, скальпелі, спиртівка, спирт для стерилізації інструментів, парафілм, фольга, ламінар-бокс, шейкер.

Хід роботи

Робота складається з кількох послідовних етапів.

Етап 1. Стерилізація і пророщування насіння моркви.

1. Простерилізувати насіння моркви (робота 4).

Умови стерилізації: витримати 2 хв у 70% етанолі, потім 15 хв – у розчині “Білизни” (1:3), тричі промити стерильною дистильованою водою (по 10 хв).

2. Стерильним пінцетом перенести насіння на безгормональне середовище МС у чашки Петрі.

3. Чашки закрити парафілмом і підписати.

4. Чашки з насінням культивувати у термостаті при 27⁰-28⁰С протягом двох тижнів.

Етап 2. Індукція ембріогенезу.

1. Стерильним пінцетом перенести проростки моркви у чашки Петрі.

2. Притримуючи проросток пінцетом, скальпелем порізати гіпокотиль на сегменти довжиною 0,5-1,0 см.

3. Сегменти гіпокотилів перенести у колби з рідким середовищем МКР-3.

4. Закрити колби кришками з фольги і підписати.

5. Колби з рослинним матеріалом культивувати у темряві при 27⁰-28⁰С на шейкері при 100 об/хв протягом трьох діб.

Етап 3. Утворення ембріоїдів.

1. Через 3 доби стерильним пінцетом дістати сегменти гіпокотилів із колби і відмити у двох порціях стерильної дистильованої води (по 10 хв).

2. Для підсушування стерильним пінцетом перенести рослинний матеріал у стерильну чашку Петрі з фільтрувальним папером.

3. Розкласти експлантати у чашки Петрі з агаровим середовищем МС.

4. Чашки закрити і підписати.

5. Чашки з рослинним матеріалом культивувати у термостаті при 27⁰-28⁰С. Через 3-4 тижні утворюються соматичні ембріоїди.

Етап 4. Пророщування ембріоїдів.

1. Через 3-4 тижні експлантати з ембріоїдами перенести у стерильну чашку Петрі.

2. Скальпелем відокремити соматичний ембріоїд і перенести у чашку Петрі з агаровим безгормональним середовищем МС.

3. Чашки з рослинним матеріалом культивувати при 28⁰С і 16-годинному фотоперіоді.

Робота 17. Непрямий ембріогенез

Мета роботи: отримати соматичні ембріоїди шляхом непрямого ембріогенезу і проростити з них рослини моркви.

Матеріали і обладнання: рослини моркви, вирощені in vitro, чашки Петрі з середовищем МКР-4 (табл. 15), чашки Петрі з середовищем МКР-5 (табл. 15), баночки з середовищем МС, стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, спирт, спиртівка, парафілм, ламінар-бокс.

ХІД РОБОТИ

Отримання рослин шляхом непрямого ембріогенезу передбачає послідовну зміну відповідних стадій культивування:

1. Індукція проембріогенної калюсної маси.

2. Розвиток ембріоїдів.

3. Проростання ембріоїдів і формування рослин.

Тому робота складається з кількох етапів, які відповідають стадіям культивування.

Етап 1. Індукція проембріогенної калюсної маси.

1. Стерильним пінцетом витягти рослину із пробірки і помістити її у стерильну чашку Петрі.

2. Притримуючи рослину пінцетом, скальпелем відрізати листки моркви і розрізати черешки листків на сегменти довжиною близько 1 см.

3. Рослинні експлантати помістити у чашки Петрі з калюсогенним середовищем МКР-4.

4. Закрити чашки парафілмом і підписати.

5. Чашки з рослинним матеріалом культивувати у термостаті при температурі 27⁰С протягом 1-2 місяців.

Етап 2. Розвиток ембріоїдів.

1. Експлантат з калюсом помістити у стерильну чашку Петрі.

2. Скальпелем відділити калюс від експлантата і поділити на рівні фрагменти.

3. Шматочки калюсу перенести на свіже живильне середовище МКР-5.

4. Чашки закрити і підписати.

5. Чашки з калюсом культивувати у термостаті при 27⁰С.

6. Один раз на місяць необхідно пересаджувати калюсну тканину на свіже живильне середовище.

При вирощуванні в цих умовах через 4-6 тижнів починається формування ембріоїдів.

Етап 3. Пророщування ембріоїдів і формування рослин.

1. Через 8-10 тижнів калюс з ембріоїдами перенести у стерильну чашку Петрі.

2. Скальпелем відокремити зрілий ембріоїд від калюсної маси і помістити на агарове безгормональне середовище МС.

У баночку поміщають по 3 ембріоїди.

3. Банки з рослинним матеріалом культивувати при 28⁰С і 16-годинниму фотоперіоді.

4. За цих умов вирощування через 6-8 тижнів із соматичних ембріоїдів виростуть рослини