- •Предмет, завдання і методологія біотехнології рослин
- •Історія розвитку методу культури клітин, тканин та органів рослин
- •Організація і обладнання біотехнологічної лабораторії
- •Посуд, інструменти і матеріали
- •Миття посуду
- •Методи стерилізації посуду
- •Методи стерилізації інструментів
- •Контрольні запитання і завдання
- •Живлення культури тканин
- •Мінеральне живлення
- •Вуглеводневе живлення
- •Вітаміни
- •Стимулятори росту
- •Фітогормони
- •Рослинні екстракти
- •РН – середовища
- •Приготування живильних середовищ
- •Стерилізація живильних середовищ
- •Стерилізація рослинного матеріалу
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих органів і зародків
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих клітин і тканин
- •Культура калюсних тканин
- •Особливості калюсних клітин
- •Генетика калюсних клітин
- •Культура клітинних суспензій
- •Культивування ізольованих клітин
- •Методи оцінки результатів
- •Мікроклональне розмноження рослин
- •Методи мікроклонального розмноження рослин
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Кріоконсервація клітин рослин
- •Контрольні запитання і завдання
- •Клітинна селекція
- •Спонтанні та індуковані мутанти
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура рослинних клітин і речовини вторинного синтезу
- •Фактори, які впливають на вихід продуктів
- •Компоненти середовища
- •Фізичні фактори
- •Селекція і відбір
- •Утворення вторинних речовин в культурах рослинних тканин
- •Глікозиди
- •Контрольні запитання і завдання
- •Культура ізольованих протопластів і соматична гібридизація
- •Виділення і очистка ізольованих протопластів картоплі
- •Виділення протопластів із мезофілу листка
- •Виділення протопластів із культури клітин
- •Культивування ізольованих протопластів
- •Умови культивування протопластів
- •Злиття ізольованих протопластів
- •Селекція соматичних гібридів
- •Генетична трансформація
- •Вектори для генетичної трансформації рослин
- •Плазміди агробактерій як вектори для трансформації
- •Вектори на основі днк-вмісних вірусів рослин
- •Методи перенесення чужинних генів у рослини
- •Трансгени і екологія
- •Контрольні запитання і завдання
- •Практичний курс Приготування і стерилізація живильних середовищ
- •Таблиця 8
- •Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (мс)
- •Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (мс). Стерилізація середовища автоклавуванням
- •Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)
- •Стерилізація рослинного матеріалу Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування асептичних рослин
- •Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ
- •Робота 6. Стерилізація листків
- •Робота 7. Стерилізація меристем
- •Калюсна культура Робота 8. Отримання первинного калюсу із різних експлантатів асептичних рослин
- •Робота 9. Дослідження явища фізіологічної полярності
- •Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури
- •Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип
- •КлітиннА суспензіЯ Робота 12. Отримання клітинної суспензії з калюсної тканини
- •Мікроклональне розмноження рослин Робота 13. Мікроклональне розмноження рослин живцями
- •Робота 14. Стебловий органогенез із листкових дисків тютюну
- •Таблиця 15 Середовища для мікроклонального розмноження тютюну та моркви (1 л середовища)
- •Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну
- •Робота 16. Прямий ембріогенез
- •Хід роботи
- •Робота 17. Непрямий ембріогенез
- •Культура ізольованих протопластів вищих рослин Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин
- •Словник термінів
- •Список літератури
Культура клітинних суспензій
Культура клітинних суспензій або суспензійна культура – вирощування окремих або невеликих агрегатів у завислому (суспендованому) стані в рідкому середовищі при використанні апаратури, яка забезпечує їх аерацію і перемішування.
Суспензійна культура використовується для вивчення фізіологічних закономірностей росту, диференціації, метаболізму соматичних клітин вищих рослин. Особливе значення має використання біосинтетичного потенціалу рослинних клітин для промислового отримання при великомасштабному культивуванні ряду економічно цінних речовин – алкалоїдів, стероїдних сполук, глюкозидів, ефірних олій, ферментів тощо.
Клітинну суспензію отримують з шматочка калюсу в рідкому середовищі, яке перемішується. Для ініціації суспензійної культури необхідно 2-3 г свіжої калюсної маси на 60-100 мл рідкого живильного середовища. Первинну суспензію отримують на коловому шейкері зі швидкістю перемішування 100-120 об/хв.
Суспензійну культуру можна отримати також із фрагмента органа рослини (листок, стебло, корінь). Спочатку на поверхні експлантата утворюється первинний калюс, а потім від нього відділяються клітини і клітинні агрегати, які дають початок клітинній суспензії.
Для отримання високо диспергованої суспензійної культури велике значення має тип вихідної калюсної тканини. Оптимальною є калюсна тканина пухкого типу, яка легко розсипається при внесенні в рідке середовище, що перемішується. Для цього калюс вирощують на середовищі з високою концентрацією ауксинів і зменшеною концентрацією або без цитокінінів і без іонів Са2+. Додавання в середовище фермента пектинази, який руйнує пектат кальцію, що склеює окремі клітини, полегшує отримання суспензії.
Необхідною умовою культивування клітинних суспензій є постійне перемішування середовища. Якщо клітинна суспензія перебуває в нерухомому стані, то ділення суспензійних клітин призводить до утворення калюсної тканини.
Первинну суспензійну культуру перед субкультивуванням фільтрують через 1-2 шари марлі, нейлонові або металічні сита, щоб позбутися від великих і щільних шматків калюсної тканини і крупних агрегатів.
Для глибинного культивування рослинних клітин користуються способами вирощування, які розроблені в мікробіології. Використовують закриті або відкриті системи в періодичному або протоковому режимах.
У закритій системі при періодичному режимі вирощування клітинна маса поміщається в певний об’єм середовища. До закінчення вирощування система залишається закритою за всіма параметрами окрім газів.
У закритій безперервній культурі у систему періодично подається свіже живильне середовище, а старе видаляється у тому ж об’ємі. Клітини залишаються в системі протягом всього періоду вирощування.
У відкриті протокові культури періодично поступає свіже середовище, однак відбирається не лише старе середовище, а й частина клітинної маси. Регуляція цього процесу може здійснюватися за принципом турбідостата або хемостата. У турбідостаті подача свіжого середовища і відбір суспензії відбуваються після досягнення клітинною суспензією певної заданої густини. Сигнал на включення поступає від реле, яке зв’язане з оптичною системою, що визначає густину суспензії. В хемостаті швидкість протоку задається експериментатором і від неї залежить швидкість росту клітинної маси. Режим хемостата дозволяє за допомогою фіксованої швидкості розбавлення підтримувати постійну швидкість поділу і густину клітин у популяції. Найпоширенішим режимом культивування клітинних суспензій є закрита періодична система. У цьому випадку для аерації і перемішування суспензії використовують різну апаратуру: ролери, шейкери (як правило колові), ферментери з механічними і магнітними змішувачами або ферментери барботажного типу, в яких аерація і перемішування здійснюється повітряним потоком.
Для роботи з суспензіями необхідно знати їхні характеристики: життєздатність, щільність клітин в суспензійній культурі, ступінь агрегованості, швидкість росту.
Життєздатність клітин визначають за їхнім забарвленням барвником (метиленова синь або синь Еванса). Живі клітини не фарбуються барвником так, як клітинні мембрани непроникні для нього. В мертві клітини фарба легко проникає, і вони забарвлюються у синій колір.
Одним із основних показників, які характеризують стан клітинної суспензії, є щільність клітинної популяції. Кількість клітин визначають в лічильній камері Фукс-Розенталя під мікроскопом після мацерації хромовою кислотою (10-20 %).
Звичайно пасаж культивування клітинної суспензії становить 14-16 днів. За цей час щільність зростає від 5·104 до 5·106 кл/мл.
Якість суспензії залежить від ступеня агрегованості її клітин. Агрегати не повинні містити більше 10-12 клітин. Для видалення крупних агрегатів суспензії фільтрують через марлеві, нейлонові або металеві фільтри. Водночас це дозволяє позбутися від залишків експлантата або щільних шматків калюсної тканини.