Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие

В иммунологическом анализе связывающая способность молекул иммуноглобулина к антигену зависит от распознавания молекул в месте связывания и их сродства. На этот характер может влиять метод, используемый для выделения иммуноглобулина.

Оценить эффективное содержание иммуноглобулинов в антисыворотке можно непрямым методом иммунофлуоресценции. Поместите 10 мкл суспензии Xanthomonas corylina (логарифмическая фаза 108 кое/мл) в каждую лунку предметного стекла и высушите при температуре 26°C. Это фиксируется спиртом в течение 10 минут, а предметное стекло высушивается промокательной бумагой. 10 мкл антисыворотки различного разведения (от 1/25 до 1/6400) добавляют в каждую лунку отдельно и дают ей прореагировать в течение 30 минут. Избыток антисыворотки дважды заливают фосфатным буфером (Nacl, 8 г; Na2HPO4, 2,7 г; NaH2PO4, 2,4 г; дистиллированная вода, 1 л; рН 7,2) в течение 5 минут. Добавьте 10 мкл конъюгированного флуоресцеином IgG или IgM козы и кролика (в зависимости от того, что должно быть оценено) в разведении 1/300 в каждую лунку и дайте реакции пройти в течение 30 минут. Удалите избыток конъюгата флуоресцеина, промыв предметное стекло фосфатным буфером трижды в течение 3 минут и высушив промокательной бумагой. Добавьте каплю глицеринового буфера (Na2HPO4.12H2O, 3,2 г; NaH2PO4.2H2O, 0,15 г; дистиллированная вода, 100 мл; глицерин дистиллированный, 50 мл) на предметное стекло и наблюдайте при погружении масла в иммунофлуоресцентный свет. Эффективное содержание иммуноглобулинов в антисыворотке оценивают на основании конечной точки разведения антисыворотки для выявления Xanthomonas corylina при ИФ.

Ключевым условием успешной диагностики бактериального штамма с помощью иммунодиагностических методов является доскональное знание специфического антитела, используемого в тесте. Некоторые растительные патогены более гетерогенны по отношению к обнаруживаемым антигенам, обнаруживаемым в естественной популяции патогенов. Некоторые бактериальные патогены могут быть надежно идентифицированы с помощью поликлональных антител, но в большинстве случаев для надежной диагностики требуется большая специфичность моноклональных антител. Сначала необходимо обратиться к соответствующей литературе, чтобы определить характеристики антитела, а также серологический состав бактериальной популяции, подлежащей обнаружению или идентификации.

Описанная процедура относится к подвиду Erwinia carotovora. атросептика. Иммунизировать мышей BALB/c внутрибрюшинным введением живых цельных клеток Erwinia carotovora subsp. atroseptica 1001, серогруппа I. Гибридизация клеток селезенки проводится по стандартным методикам. Скрининг на наличие антител проводят с помощью системы ИФА-I биотин­стрептавидин против гомологичного штамма. Реакция считается положительной, когда значение оптической плотности в три раза превышает

значение, полученное с супернатантом культуры гибридомы Xylophilus ampelinus, использованным в качестве контроля. Специфичные секретирующие антитела гибридомы клонируются в условиях ограниченного разведения с использованием фидерных слоев. Клонирование повторяют трижды, и созданные гибриды выращивают в гипоксантин-тимидиновой среде. Изотипы Nab определяют в супернатанте культуры с помощью коммерческого набора на основе иммунодиффузии (The Binding Site, Ltd. Бирмингем, Англия). Получают аскетическую жидкость, а МАБ очищают с помощью аффинной хроматографии с белком А (Бекман).

Конъюгация биотина: Приготовьте раствор, содержащий 1 мг очищенного mAb 4G4 на мл 0,1 М натриевого боратного буфера (рН 8,8), к биотинилированным антителам с N-гидроксисукцинамидным биотином (Sigma). Добавьте биотин в количестве, равном одной пятой веса используемых иммуноглобулинов. Биотин Nhydroxysuccinamide предварительно растворяется в объеме диметилсульфоксида, равном объему иммуноглобулинов, деленному на 10. Инкубируйте раствор в течение 4 часов при комнатной температуре, добавьте 20 мкл 1 М NH4 Cl на мг иммуноглобулинов и инкубируйте раствор в течение 10 минут при комнатной температуре. Несвязанный биотин удаляется 24-часовым диализом против 0,1 М фосфатного буферного физиологического раствора (PBS; рН 7,2 - 7,4).

Специфичность МАБ и ПАбс: Специфичность антител оценивают в системе ИФА-I биотин-стрептавидин. Полистирольные микропластинки (Polisorp; Nunc) покрывают суспензиями 108 КОЕ различных видов бактерий на мл в натриево-карбонатном буфере (0,05 М, рН 9,6). Специфичность также

Антитела обычно действуют как двухвалентные молекулы, а антигены­как многовалентные. Наличие слишком большого количества антител заставит антитела действовать как моновалентные молекулы только на одну частицу антигена, тем самым предотвращая образование сетчатой структуры. Слишком большое количество антигенов также препятствует образованию сетки, потому что антигены тогда будут действовать только как моновалентные молекулы. Реакция антиген–антитело не может наблюдаться ни в том, ни в другом случае.

1. Простая иммунодиффузия (Oudin, 1946): Она основана на использовании антител, иммобилизованных в агаре или агарозной матрице, расплавленной на водяной бане при температуре 50°C. Его предварительно охлаждают для использования и помещают в пробирки размером 10 × 75 мл или меньше. Антиген может диффундировать через агар, тем самым провоцируя появление зоны или полосы, мигрирующей вдоль трубки, пока концентрация обоих реагирующих веществ не достигнет оптимальной стадии. В этом месте выпадают осадки. Некоторые факторы, влияющие на миграцию полос, - это концентрация антигена и коэффициент диффузии. Последнее зависит от молекулярной массы и размера молекулы антигена. Более низкие

Реакция частичной двойной идентичности: Частичная двойная идентичность возникает между антигенами. (Почти идентичные антигены отличаются только одним антигенным детерминантом.)

Реакция частичной идентичности: Наблюдается образование “шпоры”, указывающей на частичную идентичность между антигенами (например, как в случае различных штаммов одного и того же вируса/бактерии).

Основное различие между тестами на преципитацию и агглютинацию состоит в том, что в последнем антиген очень часто больше антитела. По этой причине для формирования видимой группы частиц необходимо очень мало молекул антител. Принципы, регулирующие реакции, аналогичны принципам испытаний на осаждение.

3. Испытания на нейтрализацию. В некоторых случаях взаимодействие биологически активных антигенов с гомологичными антителами приводит к потере биологической активности антигена. Эта реакция называется нейтрализацией. Поскольку чувствительность этих тестов принципиально зависит от активности антисыворотки, активность антигена должна быть биологически детектируемой.

2. Радиоиммунология: Иммуноглобулины помечены радиоактивными веществами (Р32, I128). Их присутствие определяется реакцией на фотоматериал.

3. Иммунологические анализы с ферментативными конъюгатами: Эти тесты основаны на свойстве определенных антигенов и антител поглощаться в твердую среду, что позволяет им построить упорядоченную последовательность биологического материала (антитело, антиген, антитело, конъюгированное с ферментом), и которая может рассматриваться как цветовая реакция, возникающая в результате добавления фермент­специфического субстрата, конъюгированного с антителом, что позволяет адекватно количественно определить антиген. В зависимости от исследовательских потребностей часто используются следующие анализы такого рода: DAS-ELISA (Двойной сэндвич антител) NCM-ELISA (Нитроцеллюлозная мембрана).

бактерий в тканевой суспензии готовят адекватное разведение специфической