Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
371
Поражение листьев: Почернение и увядание больших участков листьев
из-за инфекции, которая придает листве испорченный вид.
Пятно листа: Образование пятен различного размера, формы и цвета на
спинной или брюшной поверхности листа. Эти пятна могут быть круглыми,
яйцевидными, неправильной формы, с ореолом или без него, желтоватыми,
коричневыми, черными, темными, слабыми, пропитанными водой и так далее.
Некроз корневой коры: На коре корневой системы зараженного растения
появляется коричневато-черная некротическая область, которая показывает
пожелтение и опадание листьев с увяданием нескольких ветвей растений.
Впоследствии все растение увядает и погибает.
Корневая гниль: Гниение корней, их распад и опадание листвы растений
из-за недостатка питательных веществ для растений.
Поражение рассады: Молодые растущие саженцы поражаются из-за
инфекции. Мягкая гниль: Инфекция приводит к мацерации мягких тканей
листьев и плодов с мясистым внешним видом и неприятным запахом.
Поражение веток: Инфекция привела к почернению или осветлению
отдельных веток случайным образом на растении.
Поражение вен: Бактериальная инфекция привела к осветлению или
почернению вен листьев, например, поражение вен листьев хлопка.
Замачивание водой: Бактериальная инфекция привела к появлению
пропитанных водой полупрозрачных пятен/участков на листьях, ветках или
плодах.
Увядание: Увядание и гибель всего растения во время его активной фазы
роста.
38.2. Измерение пятнистости листьев/болезней, вызываемых гнилью
Бактериальная инфекция в культурных растениях может быть
зарегистрирована с точки зрения заболеваемости и интенсивности, а затем
вычислена.
372
Заболеваемость: Подсчитайте количество зараженных растений (в случае
фруктовых садов) и площадь зараженных культур в поле (в случае полевых
культур).
Интенсивность: Подсчитайте площадь зараженной листвы из общей
площади листвы. Дайте различные оценки для зараженной области листвы.
373
39. ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО СОЕДИНЕНИЯ
Для борьбы с бактериальной инфекцией требуются антибактериальные
соединения. Антибактериальное соединение может присутствовать в
определенных растениях или может быть выделено из определенных
микроорганизмов. Тестирование этих антибактериальных соединений против
патогенных бактерий растений и их идентификация на молекулярном уровне
имеет важное значение.
39.1. Метод предварительной оценки для определения наличия
антибактериального соединения в растении путем вычисления
бактериальной популяции
Метод, предложенный Юмлембамом и Боркаром (2014), заключается в
следующем.
I. Нумерация бактериальных эпифитов на поверхности листьев
Необходимый Материал
Испытательное растение, пластины с питательным агаром и так далее.
Методика
Метод отпечатков листьев используется для подсчета бактериальной
популяции на поверхности листьев тестируемых растений. Для этого собирают
листья тестового растения, продувают воздухом для удаления грязи/пыли, а
затем отпечатывают на пластинах питательного агара (как на спинной, так и на
брюшной стороне листьев на соответствующих пластинах). Инкубируйте
пластины с отпечатками листьев в течение 48 часов в инкубаторе BOD при
температуре 28 ±1 °C и обратите внимание на рост бактериальных колоний с
плотностью их популяции.
II. Количество бактериальных эндофитов в ткани листа
Методика
Для определения количества бактериальных эндофитов в листьях
тестируемых растений промойте листья соответствующих растений в
водопроводной воде, чтобы удалить грязь. Эти листья подвергают
374
поверхностной стерилизации в хлориде ртути (0,1 процента) в течение 2 минут,
а затем трижды промывают дистиллированной стерилизованной водой.
Стерилизованные 5 г листьев размачивают в стерильной ступке и пестике в 10
мл воды и оставляют на 10 минут. Супернатант наносится полосками на
пластины питательного агара с помощью стерилизующей инокуляционной
иглы. Инкубируйте привитые пластины при температуре 28 ±1 °C и
наблюдайте за развитием бактериальных колоний до 3 дней и отмечайте рост
различных колоний с их плотностью популяции.
Отсутствие бактериальных эндофитов указывает на вероятное
присутствие антибактериального соединения в тестируемом растении, а
отсутствие грамотрицательных или грамположительных бактерий или и тех, и
других указывает на то, что антибактериальное соединение активно против
какого типа бактерий.
39.2. Оценка антибактериальных свойств растений
Необходимый материал
Тестовая установка, тестовая бактериальная культура, заготовка для
воды, пластины с питательным агаром, измельчитель, фильтровальная бумага
Whatman и фильтры G-4.
Протокол 1
Измельчите образец растения (крыша, листья, плоды, семена, кора и т.д.,
согласно тесту) в 5 мл дистиллированной воды с помощью пестика и ступки и
дайте отстояться в течение 10 минут. Нанесите надосадочную жидкость на
пластину и инкубируйте пластины при температуре 27 ±2 °C в течение 3 дней.
Наблюдайте за ростом бактериальных колоний на полосатых участках.
Образование бактериального роста на прожилках указывает на то, что
образец не обладает антибактериальной активностью. Отсутствие
бактериальных колоний на полосах указывает на то, что образец обладает
антибактериальным соединением.
Протокол 2
375
Теперь промойте тот же образец (5 г) в проточной водопроводной воде,
чтобы удалить грязь, высушите и раздавите в 10 мл дистиллированной
стерильной воды и дайте застыть в течение 10 минут. Отфильтруйте
надосадочную жидкость через двойной слой муслиновой ткани, затем фильтр
Ватмана № 42 и фильтр G-5. Приготовьте пластины с тестируемой бактерией в
питательной агаровой среде, смешав бактериальную культуру в теплой
питательной агаровой среде и поместив в стерилизованные пластины Петри.
Когда среда с бактериальной культурой затвердеет, поместите 0,1 мл экстракта
исследуемого растения в центр пластины и инкубируйте при 27 ±2 °C в течение
48 часов в инкубаторе. Наблюдайте за пластиной для образования зоны
ингибирования растительным экстрактом.
Образование зоны ингибирования указывает на наличие
антибактериальных молекул в растительном экстракте и на то, что часть
растения обладает антибактериальными свойствами.
39.3. Эффективность водного экстракта лекарственного растения против
патогенных бактерий растений (Xanthomonas spp.)
Необходимый материал
Испытательное растение, тестовая бактерия, пластины с питательным
агаром, дистиллированная стерильная вода и так далее.
Методика
Суспендируйте бактериальные культуры в стерильной
дистиллированной воде, отрегулируйте до 0,1 OD при 620 нм (107 кое/мл) и
используйте в качестве инокулятов. Из этого добавьте 0,5 мл каждой
бактериальной инокуляции соответственно к 10 мл водного стерилизованного
экстракта листьев, 5 мл стерилизованного водного экстракта листьев,
смешанного с 5 мл стерилизованного питательного бульона, и 5 мл
питательного бульона в качестве контроля. Инкубируйте пробирки при
температуре 28 ±1 °C в течение 48 часов, чтобы ксантомонада могла расти в
этих экстрактах листьев и питательном бульоне. После 48 часов инкубации
376
петлю из инкубированной суспензии наносят на среду NAS для обнаружения
колоний ксантомонас.
Отсутствие роста бактерий из водного экстракта листьев/экстракта
листьев с питательным бульоном указывает на наличие антибактериальной
молекулы/соединения в экстракте листьев тестируемого растения.
39.4. Приготовление экстракта растений в растворителях
Для приготовления 5-процентного экстракта листьев в растворителе (5 г
листьев в 100 мл растворителей), 10-процентного экстракта листьев (10 г
листьев в 100 мл растворителей) и 25-процентного экстракта (25 г листьев в 100
мл растворителей) тщательно промойте образцы листьев водопроводной водой
и мацерируйте отдельно с соответствующими растворителями, а именно
стерилизованной дистиллированной водой, этанолом и метанолом. Экстракты
растворителей затем просеивают через двухслойную муслиновую ткань и
затем центрифугируют при 4000 ×g в течение 30 минут. Надосадочная
жидкость фильтруется через Whatman no. 1 фильтровальная бумага и
стерилизованная через бактериальные фильтры G4 для получения стерильных
экстрактов. Эти экстракты растворителей высушиваются в вакууме и могут
быть использованы для дальнейших исследований антибактериальных
свойств.
39.5. Оценка и количественное определение эквивалентного
антибактериального соединения в растительном экстракте-растворителе
Необходимый материал
Бактериальный газон тестируемой бактерии, растительный экстракт в
растворителях, диск пайпера, известная концентрация антибиотиков и так
далее.
Методика
Для оценки антибактериальных свойств экстракта растворителя готовят
бактериальный газон путем добавления бактериальной суспензии (2 мл) в
питательную агаровую среду (20 мл) и разливают в чашки Петри.
Стерилизованный бумажный диск (Ватман № 1,5 мм) погружают в
377
стерилизованный растворяющий экстракт, то есть водный, этанольный и
метанольный экстракт соответственно, и помещают на предварительно
налитые бактериальные пластины.
В качестве контроля используется диск селективных синтетических
антибиотиков сульфата стрептомицина в концентрации 50, 100, 250 и 500
частей на миллион. Инкубируйте пластины при температуре 28 ±1 °C в течение
24 часов, чтобы наблюдать зону торможения вокруг диска.
Наличие прозрачной зоны указывает на наличие антибактериальной
активности в соответствующем экстракте. Зона ингибирования известной
концентрации антибиотиков используется для сравнения и количественного
определения эквивалентного антибактериального соединения в растворяющем
растительном экстракте.
39.6. Выделение антибактериального соединения из растительного
источника
Необходимый материал
Водный экстракт образца растения, различные растворители,
разделительные воронки, вакуумный испаритель, флаконы и так далее.
Методика
Приготовьте водный экстракт образца растения, который проявил
антибактериальную активность в отношении исследуемой бактерии. Возьмите
25 мл водного экстракта (отфильтрованного через фильтровальную бумагу
Ватмана) в разделительную воронку и добавьте равный объем
соответствующего растворителя. Энергично встряхните экстракт растворителя
и дайте ему отстояться в течение 10 минут. Удалите и соберите растворяющий
фаг, высушите его в вакуумном испарителе. Растворите высушенное вещество
в 2 мл дистиллированной стерильной воды и храните в стерильном флаконе.
Примечание: Для извлечения бактерицидного соединения необходимо
использовать другой растворитель. Подготовьте пластины с тестируемым
патогеном на питательной агаровой среде, как описано ранее, и нанесите 0,1 мл
экстрагированного растворителем вещества в центр пластины. Инкубируйте
378
пластину при температуре 27 ±2 °C в инкубаторе в течение 48 часов, чтобы
наблюдать зону торможения.
Примечание: Необходимо следовать той же процедуре для определения
растворимости бактерицидного соединения в различных растворителях для
дальнейшей надлежащей экстракции и выбора растворителя.
Наблюдение
Отметьте зону ингибирования в пластинах из различных экстрагируемых
растворителем материалов и определите подходящий растворитель, который
будет использоваться для выделения антибактериального соединения.
39.7. Выделение антибактериального соединения из микробного
источника
Необходимый материал
Бесклеточный экстракт микробного роста, другой растворитель,
разделительная воронка, вакуумный испаритель, флаконы и так далее.
Методика
Выращивайте антибактериальный микроб в соответствующем бульоне
(используйте картофельный бульон с декстрозой для грибкового и
питательного бульона для роста бактерий) в течение 7 дней на вращающемся
шейкере при температуре 27 ±2 °C. Отфильтруйте бульон через
фильтровальную бумагу whatman № 42 для сбора бесклеточного экстракта для
роста грибков или через фильтр G-5 для роста бактерий с помощью вакуумной
фильтрации. Возьмите 25 мл бесклеточного экстракта в разделительную
воронку и добавьте равный объем соответствующего растворителя. Энергично
встряхните экстракт растворителя и дайте ему отстояться в течение 10 минут.
Удалите и соберите фазу растворителя и высушите ее в вакуумном испарителе.
Растворите высушенное вещество в 2 мл дистиллированной стерильной воды
и храните в стерильном флаконе.
Примечание: Для извлечения бактерицидного соединения необходимо
использовать другой растворитель. Подготовьте пластины с тестируемым
патогеном на питательной агаровой среде, как описано ранее, и поместите 0,1
379
мл экстрагированного растворителем вещества в центр пластины.
Инкубируйте пластину при температуре 27 ±2 °C в инкубаторе в течение 48
часов, чтобы наблюдать зону торможения.
Примечание: Необходимо выполнить ту же процедуру для определения
растворимости бактерицидного соединения в другом растворителе для
дальнейшей надлежащей экстракции и выбора растворителя.
Наблюдение
Отметьте зону ингибирования в пластинах из различных экстрагируемых
растворителем материалов и определите подходящий растворитель, который
будет использоваться для выделения антибактериального соединения.
39.8. Тестирование эффективности антибактериальной молекулы
Необходимый материал
Извлеченная молекула, тестируемый патоген, питательная агаровая
среда, бумажный диск, известные антибиотики, водные заготовки и так далее.
Методика
Приготовьте 1 мл суспензии экстрагированной молекулы. Приготовьте
25, 50, 100, 250 и 500 частей на миллион растворов известного антибиотика
(сульфата стрептомицина, стрептоциклина, бактериального и т.д.).
Подготовьте питательные агаровые пластины с тестируемой бактерией, как
описано ранее, и дайте среде затвердеть. Окуните отдельный стерилизованный
бумажный диск Ватмана в суспензию извлеченной молекулы и в различные
концентрации раствора антибиотика. Поместите эти диски на пластинку с
тестируемой бактерией, когда среда затвердеет. Точно отметьте место
установки диска. Инкубируйте пластины при температуре 27 ±2 °C в течение
48 часов и запишите зону ингибирования.
Запишите и измерьте зону ингибирования различных концентраций
известного антибиотика и зону ингибирования тестируемой молекулы.
Сравните зону ингибирования, чтобы рассчитать концентрацию
антибактериального вещества, присутствующего в исследуемой молекуле.
380
Рассчитайте количество антибактериальной молекулярной экстракции на литр
экстракта.
39.9. Идентификация антибактериальной молекулы
Идентификация антибактериальных молекул может быть проведена с
помощью газовой хроматографии масс-спектроскопии (GC.MS) с помощью
устройства Quattro micro GC-MS. Используемый тип колонки - DB-SMS с
длиной колонки 30 м, капиллярная колонка из плавленого кремнезема (диаметр
0,25 мм; толщина пленки 0,25 мкм) и использование газа-носителя в качестве
гелия. Входное давление удерживается на уровне 5 фунтов на квадратный
дюйм в течение 1 минуты, затем повышается на 20 фунтов на квадратный
дюйм/мин и удерживается в течение 4,5 минут. Скорость потока
поддерживается на уровне 1 мл/мин при начальной температуре колонки 50°C
и конечной температуре 280°C. Скорость изменения температуры в колонне
поддерживается на уровне 25°C в минуту в течение 6 минут, пока конечная
температура не достигнет 150°C, затем ее поддерживают на уровне 5°C в
минуту в течение 36 минут, пока она не достигнет 280°C, со временем
выдержки 4 минуты.
Выполните следующую процедуру для анализа GC-MS тестируемого
соединения.
I. Подготовка образца
Разбавьте 10 процентов растительного экстракта этанола и метанола
соответствующим растворителем, а именно. Этанольный экстракт в
этилацетате и метанольный экстракт в метаноле для достижения конечной
концентрации 20 частей на миллион (это достигается добавлением 10 мкл
исследуемого образца в 2 мл растворителя, из которого 40 мкл дополнительно
разбавляют в 1 мл растворителя, получая конечную концентрацию 20 частей на
миллион).
II. Очистка образца
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]