Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
361
две контрольные пластины TSA и две минимальные контрольные пластины с
агаром, инокулированные отдельным штаммом E.coli, а также на минимальную
пластину, инокулированную смешанной культурой. Подсчитайте количество
колоний на всех пяти пластинах и запишите результаты.
Контрольные пластины с триптиказным соевым агаром (TSA) будут
демонстрировать рост двух ауксотрофных штаммов E. coli (т. Е. thr+ met– и thr–
met+) на полной среде, но без роста этих штаммов на минимальных агаровых
(контрольных) пластинах. Рекомбинантные фототрофные колонии E. coli
будут наблюдаться на экспериментальной минимальной агаровой пластинке в
результате конъюгации двух ауксотрофных штаммов E. coli.
Во время конъюгации хромосомы двух ауксотрофов связываются и
подвергаются рекомбинации, в результате чего образуется рекомбинантный
штамм с генетическим составом thr+met+. Количество колоний, подсчитанных
на экспериментальной минимальной агаровой пластинке, можно сравнить с
контролем, чтобы оценить процент произведенных рекомбинантов.
Один и тот же тип экспериментов может быть проведен для штамма
патогенных бактерий растений, имеющих различные биохимические
требования.
35.3. Передача генетического материала посредством трансдукции
Трансдукция требует бактериофага в качестве вектора для передачи
генетического материала (ДНК) от одной бактерии к другой. Бактериофаг
приобретает часть генетического материала инфицированной бактерии. Когда
он высвобождается и заражает другую бактериальную клетку, генетический
материал первой клетки интегрируется с ДНК второй бактерии. Таким
образом, различные символы могут быть перенесены из одной бактериальной
клетки в другую, что показывает новые или другие символы. Механизм может
действовать у патогенных бактерий растений для передачи геномного
характера и может быть продемонстрирован.
Необходимый материал
362
Патогенная, но литическая культура ксантомонад, непатогенная
лизогенная культура той же бактерии, фаг бактерии, питательный бульон,
питательные агаровые пластины, бактериологический фильтр, тестовое
растение-хозяин и так далее.
Методика
Получить патогенную, но литическую культуру ксантомонад (доказать
патогенность культуры на растении-хозяине и ее литическую природу с
помощью реакции фага). Получить непатогенную, но лизогенную культуру той
же бактерии (доказать авирулентность культуры на растении-хозяине и ее
лизогенную природу с помощью реакции фага). Выращивайте культуру
патогенной тестовой ксантомонады в питательном бульоне в течение 24 часов
при температуре 27 ±2 °C и добавьте в нее 0,5 мл раствора литического фага.
Инкубируйте привитый бульон при температуре 27 ±2 °C в течение 12 часов и
фильтруйте через бактериологический фильтр G-5 для получения фагов.
Выращивайте непатогенную культуру ксантомонады в питательном бульоне в
течение 24 часов при температуре 27 ±2 °C и добавьте 0,5 мл раствора фага,
полученного лизисом патогенной культуры. Инкубируйте привитый бульон
при температуре 27 ±2 °C в течение 12 часов и нанесите полоску на пластинку
с питательным агаром. На основе характера колонии и опыта выберите
колонии, получите их наклон и проверьте на патогенность на растениихозяине.
Если авирулентная культура становится патогенной во время
эксперимента, это означает передачу генетического материала в процессе
трансдукции.
Примечание: Патогенный характер ксантомонад переносится на
хромосомную ДНК, а не на плазмидную ДНК (Боркар, 1982), и для передачи
генетического материала через фаги происходит интеграция бактериальной
хромосомы с фаговой хромосомой.
363
36. ПОПУЛЯЦИОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ
БАКТЕРИЙ РАСТЕНИЙ НА/В РАСТЕНИИ-ХОЗЯИНЕ
Бактериальная популяция играет важную роль в индукции и появлении
симптомов заболевания. Даже одна бактерия может инициировать инфекцию
(Клемент и Гудман, 1967), но требуется относительно больше времени.
Большая популяция бактерий означает более быстрое развитие симптомов.
36.1. Оценка бактериальной популяции методом промывки листьев
Необходимый материал
Пластины питательного агара, дистиллированная стерильная вода,
магнитная мешалка, свежие листья растений, пипетки и так далее.
Методика
Соберите свежие листья растения без симптомов и взвесьте их. В случае,
если листья большого размера, нарежьте их небольшими кусочками по 3 см2.
Суспендируйте этот листовой материал (приблизительно 1 г) в 25 мл
дистиллированной стерильной воды в небольшой конической колбе и
перемешивайте на вращающемся шейкере в течение 10 минут. Пипеткой
извлеките 0,2 мл аликвоты этой взбалтанной суспензии и сделайте
последовательное разведение до 10-6.
Нанесите 0,1 мл этой суспензии на пластины с питательным агаром,
распределите стеклянной палочкой и инкубируйте при 27 ±2 °C в инкубаторе в
течение 3 дней.
Наблюдайте и подсчитывайте бактериальные колонии в пластинах
каждого разведения и определяйте общую популяцию бактерий на лист или на
грамм листа.
Примечание: Колонии сапрофитных бактерий появляются на пластинах
питательного агара через 24 часа, в то время как колонии патогенных бактерий
растений появляются только через 48-72 часа. Обязательно подсчитайте эти
колонии, чтобы определить эпифитную популяцию патогенных бактерий
растений.
364
36.2. Оценка популяции эпифитов методом отпечатков листьев
Необходимый материал
Свежие листья растения, пластины питательного агара, антибиотик
ауреофунгин.
Методика
Приготовьте питательные агаровые пластины со 100 ppm ауреофунгина.
Положите спинную сторону листа на питательную агаровую среду и слегка
надавите на лист, чтобы создать впечатление листа на среде. Выньте лист после
того, как сделаете оттиск.
На другую пластинку с питательным агаром положите брюшную сторону
того же листа и слегка надавите на лист, чтобы создать впечатление листа на
среде. Выньте лист после того, как сделаете оттиск. Инкубируйте пластины при
температуре 27 ±2 °C в инкубаторе в течение 48 часов и отметьте
бактериальную популяцию на отпечатке листа на носителе.
Наблюдение
Обратите внимание на колонию бактерий, типы и их расположение на
отпечатке листа.
36.3. Оценка эндофитной популяции методом последовательного
разведения
Необходимый материал
Образец зараженной болезни, пластины с питательным агаром, заготовка
для воды, пестик и ступка, пипетки и так далее.
Методика
Измерьте зараженную область или участок на листьях/веточке и
разрежьте их на мелкие кусочки. Стерилизуйте их 0,1-процентным раствором
хлорида ртути с тремя промывками дистиллированной стерильной водой.
Размачивают образец болезни в 5 мл стерилизованной воды в пестике и ступке
и дают отстояться в течение 5 минут. Пипеткой извлеките 0,2 мл аликвоты этой
суспензии и сделайте последовательное разведение до 10-6. Пипеткой
выдавите 0,1 мл каждого разведения и выложите на питательную агаровую
365
среду и распределите стеклянной палочкой. Инкубируйте пластины при
температуре 27 ±2 °C в инкубаторе в течение 48-72 часов. Понаблюдайте за
пластинкой и подсчитайте колонии бактерий.
Подсчитайте бактериальные колонии патогенных бактерий растений и
других эндофитных бактерий в каждой пластинке для разведения и определите
исходную популяцию, имеющуюся в образце.
36.4. Динамика численности бактерий в растении-хозяине
Это упражнение обозначает размножение бактериального патогена/расы
в разных сортах одного и того же растения-хозяина, чтобы отметить их
популяцию в сорте-хозяине с различным генетическим фоном.
Необходимый материал
Привитые листья с бактериальным патогеном, пробковый сверлильный
станок, пластины питательного агара, пестик и ступка, хлорид ртути,
дистиллированная стерильная вода, стерилизованная пипетка, стеклянная
палочка и так далее.
Методика
Инфильтрируйте суспензию молодого роста Xcm-race-32 и Xcm-race-8
(при 0,1 вымирании при 620 нм) в листьях Acala-44 (восприимчивы к Xcm-32
и Xcm-8), 1-10B (восприимчивы к Xcm-32, но устойчивы к Xcm-8) и 101-102B
(устойчивы к Xcm-32 и Xcm-8). Через определенные промежутки времени (4
часа) инфильтрированные участки вырезают с помощью пробкового сверла
(диаметром 8 мм) и вынимают в виде листовых дисков. Промойте три таких
листовых диска в дистиллированной воде и стерилизуйте поверхности
листовых дисков, окунув их в 0,1 % хлористую ртуть в течение 1 минуты с
последующей промывкой дистиллированной стерилизованной водой.
Размачивают эти листовые диски в 2 мл стерилизованной воды и доводят объем
до 10 мл. Из этой суспензии сделайте последовательное разведение и нанесите
0,1 мл каждого разведения на питательную среду с сахарозой и агаром и
инкубируйте пластины в трех экземплярах при 28°C в течение 4 дней. Возьмите
366
количество колоний и рассчитайте численность бактерий на площадь см2
(Боркар и Верма, 1984b).
36.5. Выделение межклеточной жидкости для изучения роста бактерий
Межклеточная жидкость обеспечивает идеальное питание для роста и
размножения бактериальных патогенов растений. Аналогичным образом, он
может быть использован для выделения бактериальных метаболитов, таких как
ферменты и токсины бактериальных патогенов растений.
Необходимый материал
Свежие листья растения-хозяина, аппарат для вакуумной фильтрации,
коническая колба с клювом, дистиллированная стерильная вода, настольная
центрифуга с центрифужной трубкой, фильтры G-5.
Методика
Метод получения межклеточной жидкости (IF) из листьев такой же, как
был использован Клементом (1965). Сорвите листья растения-хозяина и
тщательно промойте дистиллированной водой. Эти листья пропитываются
водой, погружая их под воду в вакууме. Выньте листья и удалите излишки воды
с их поверхности, прижав их к промокательной бумаге. 65 г пропитанных
листьев разрезают вдоль, сворачивают и помещают в центрифужную пробирку
над перфорированной опорой, чтобы предотвратить перемещение кусочков
листьев на дно. Листья центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 минут.
Межклеточная жидкость вытесняется из межклеточных пространств и
собирается в нижней части центрифужной трубки. 25 мл IF стерилизуют путем
фильтрации через бактериологический фильтр из спеченного стекла
(ультратонкий G-5) для дальнейшего использования для изучения роста
бактерий, выработки ферментов или выработки токсинов бактериальным
растительным патогеном.
367
37. СОХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ
Сохранение образцов заболеваний очень необходимо для ведения учета
заболевания и типов симптомов, возникших или описанных в данный момент
времени. Это достоверное доказательство заболевания, о котором сообщалось
в определенный период.
37.1. Сухая консервация образцов
Метод используется для сохранения образцов листьев, веток или корней.
Необходимый материал
Свежие образцы болезней, ножницы, промокательная бумага, раствор
хлорида ртути, газетная бумага, бумажные конверты.
Методика
Соберите зараженный лист, веточку или корень с больного растения.
Промойте в проточной водопроводной воде, чтобы удалить грязь, и
промокните излишки воды промокательной бумагой. Поместите образец в
раствор хлорида ртути (0,1 процента), чтобы избавиться от нежелательных
сапрофитных грибковых и бактериальных загрязнений. Пропитайте
промокательную бумагу и поместите образец в естественное положение на
газетном листе на ночь под сильным давлением или прессом для одежды.
Поместите образец в бумажный конверт и должным образом наклеите этикетку
с названием заболевания, местом сбора, датой сбора, именем коллекционера и
так далее. Проверяйте образец с регулярным интервалом до одного месяца.
Образец без деградации или загрязнений/чрезмерного роста должен быть
окончательно использован для сохранения в течение длительного времени.
37.2. Способ микроволновой сушки
Там, где климатические условия не подходят для сухого метода
консервирования, может быть применен метод микроволновой сушки. При
этом методе лучше сохраняется цвет образца, и он может храниться в течение
длительного времени без выцветания.
368
Держите листья образца болезни в микроволновой печи и включите
микроволновую печь на 1 минуту. Выньте листья, храните в газетных складках
в течение 3 дней в условиях пресса, а затем храните в бумажных пакетах.
37.3. Сохранение образцов в консервирующих растворах
В зависимости от цвета болезнетворных листьев или плодов, необходимо
выполнить пропитку консервирующим раствором, чтобы сохранить тот же
цвет материала-хозяина для его сохранения.
Пропитка зеленого цвета Образца листа
Для сохранения зеленого цвета используется пропиточный раствор
ацетата меди. Постепенно увеличивайте кристаллизацию ацетата меди в 50процентном растворе уксусной кислоты (пока он больше не растворится).
Разбавьте это водой от 3 до 4 раз в соответствии с цветом образца, который
нужно сохранить. Кипятите эту смесь вместе с образцом до тех пор, пока
зеленый цвет образца не исчезнет. Охладите раствор. Через 3-4 минуты
зеленый цвет восстанавливается. Извлеките образец, промойте
дистиллированной водой и храните в 5-процентном растворе формалина.
Примечание: Образцы фруктов, такие как светло-зеленые яблоки, груши,
виноград и т. Д., Нельзя варить, и поэтому их непосредственно замачивают в
смеси 1 % сульфита (100 мл), 95 % спирта (100 мл) и 800 мл воды в течение 1020 дней. Затем удалите, промойте и храните в 5-процентном растворе
формалина.
Пропитка красного цвета
Для образцов красных фруктов, таких как клубника, перец, картофель и
другие образцы красных растений, в качестве пропитывающего раствора
используется нитрат кобальта (15 г), формалин (25 мл), хлорид (10 г) и вода (1
л).
Замочите образец в этой смеси на 2 недели, а затем очистите, промыв
водой. Затем консервируют в смеси сернистой кислоты (30-50 мл), формалина
(10 мл), 95-процентного этанола (10 мл) и воды (1 л).
Пропитка желтого или оранжевого цвета
369
Содержащие каротин фрукты, такие как лютеин и абрикос, груша, хурма,
цитрусовые и т. Д., замачивают в подсернистой кислоте (содержащей SO2, 5
%) 4-10-процентного водного раствора.
Пропитанный образец может быть сохранен в смеси формалина (50 мл),
95-процентного этанола (300 мл) и воды (2 л).
37.4. Сохранение образцов пятнистости/гнили листьев путем
ламинирования
Необходимый Материал
Образец зараженного листа, раствор хлорида ртути, промокательная
бумага.
Методика
Соберите зараженные (пятна на листьях/гнили) листья. Промойте их в
водопроводной воде, чтобы удалить грязь. Замочите лишнюю воду в
промокательной бумаге. Поместите образец листа в раствор хлорида ртути (0,1
процента) на 1 минуту, чтобы избавиться от нежелательных сапрофитных
грибковых и бактериальных загрязнений. Замочите в промокательной бумаге.
Ламинируйте лист в его естественной форме.
37.5. Сохранение образцов фруктов путем обработки воском
Необходимый Материал
Образец зараженного плода, жидкий парафин.
Методика
Соберите образец зараженного плода. Удалите грязь, промокнув
влажной ватой с последующим раствором хлорида ртути (0,1 процента).
Окуните образец плода в жидкий парафин и выньте, чтобы получить восковое
покрытие. Храните образец в контейнерах для отбора проб или витринах.
370
38. ИЗМЕРЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ РАСТЕНИЙ
38.1. Глоссарий для описания симптомов
Черная рука: Черная рука относится к бактериальной инфекции, когда
основной, вторичный и третичный стебель растения становятся черными из-за
бактериальной инфекции, например, черная рука хлопка.
Волдыри: Гладкий приподнятый нарост на листьях или кожуре плодов.
Эти приподнятые отростки от черного до коричневого цвета с выделяющимися
полями или ореолом или без них.
Цветочная гниль: Бутоны, цветы или цветение пропитываются водой,
чернеют и увядают; придает поврежденный вид.
Язвы: Пробковый нарост на поверхности листьев, поверхности веток или
кожуре плодов; Пробковые наросты обычно имеют желтоватый вид.
Корончатые галлы: Инфекция привела к образованию галлов разного
размера на уровне кроны ствола растения.
Дефолиация: Опадание листьев с растения из-за инфекции.
Отмирание: Инфекция привела к гибели молодых побегов и стеблей
сверху донизу растения.
Пожарная болезнь: Когда симптомы болезни появляются в одночасье и
очень быстро распространяются на всю плантацию или урожай.
Пятно на плодах: Бактериальная инфекция привела к появлению пятен
разного размера и цвета на плодах.
Галлы: Образование галлов различных размеров и форм на веточках,
стебле и так далее.
Реакция гиперчувствительности: Бактериальная инфекция привела к
быстрому потемнению или тусклой зеленоватой реакции зараженной области
листа.
Взрыв листьев: Пожелтение, потемнение и высыхание больших участков
листьев, что придает листве опаленный вид.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]