Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
191
Тестирование на наличие фермента
Подготовьте микротомный срез здоровых тканей клубня колокацеи и
поместите их в изолированный ферментный раствор, а несколько срезов-в
дистиллированную воду на 8-10 часов. Удалите срезы микротома и окрасьте
их, как описано в разделе 3.3.1, для деградации пектатного вещества и
наблюдайте под микроскопом.
Прозрачный диализированный раствор (или недиализированный
раствор) - это сырой пектиновый фермент, который может быть использован
для различных тестов. Добавьте несколько капель толуола, когда он не
используется, и храните при температуре 4°C.
23.3.2.2. Извлечение пектолитических ферментов из патогена (In Vitro)
Бактериальные патогены растений, например Erwinia, продуцируют
пектиновые ферменты в питательных средах, дополненных пектиновыми
веществами (т. е. индуцированными ферментами). Извлечение
пектолитических ферментов производится из инокулированного бульона
Чапека с добавлением пектина.
Необходимый материал
Жидкая среда Чапека (бульон), содержащая 1-2% пектина (рН 6,5), 500
мл колбы Эрленмейера, воронка Бюхнера, 5 мл пипетки, целлофановая
диализирующая трубка, центрифуга, холодильник.
Методика
Возьмите по 100 мл отвара Чапека в конических колбах по 500 мл.
Асептически инокулируйте колбы культурой эрвинии и инкубируйте
инокулированные колбы при температуре 26°С в течение 7 дней. Фильтруйте
через фильтровальную бумагу Whatman № 1. Центрифугируйте фильтрат при
10000 об / мин в течение 30 минут, чтобы удалить бактерии в форме поддона.
Возьмите супернатант в целлофановые пробирки и диализируйте против
дистиллированной воды при температуре 4°C (холодильник) в течение 24
часов, меняя воду каждые 8 часов.
Тестирование на наличие пекотолитических ферментов
192
Следуйте процедуре, описанной ранее. Прозрачный диализированный
фильтрат (или недиализированный фильтрат) - это сырой пектиновый фермент.
Добавьте несколько капель толуола и храните при температуре 4°C, когда он
не используется.
23.3.2.3. Анализ полигалактуроназы
Полигалактуроназа (ПГ) расщепляет или гидролизует а-1,4-гликозидные
связи пектиновых веществ (пектиновых кислот), высвобождая галактуроновые
кислоты различных размеров. Гидролиз пектиновых кислот ПГ может
происходить по случайным (эндо-ПГ) или терминальным (экзо-ПГ) связям.
ПГ (эндо) можно определить физическим методом, основанным на
потере вязкости полипектата натрия или пектиновой кислоты, или
химическим, измеряя количество галактуроновых кислот титрованием. ЭкзоПГ определяется методом нисходящей бумажной хроматографии.
Определение эндо-полигалактуроназы (Эндо-ПГ) определяют по потере
вязкости полипектата натрия и оценке восстановительных групп методом
титрования.
ПГ по оценке редуцирующих групп
Необходимый материал
Ферментный экстракт/фильтрат, 1% полипектат натрия (приготовленный
в буфере ацетат–уксусная кислота натрия, рН 5,2), 1 М Na2CO3 (безводный)
раствор, 0,1 Н тиосульфат натрия, 2 М H2SO4, 0,1 Н раствор йода, 100 мл колбы
Эрленмейера, 100 мл стеклянные колбы Эрленмейера с пробкой, 5 мл пипетка,
25 мл бюретка, водяная баня (30°С).
Методика
Возьмите 20 мл полипектата натрия (1%), приготовленного в ацетатном
буфере в колбе Эрленмейера. Добавьте 20 мл фермента в колбу, чтобы довести
конечную концентрацию субстрата до 0,5 процента. Инкубируйте смесь при
температуре 30°C в течение 2 часов. Пипеткой 5 мл аликвоты из
инкубированной реакционной смеси через 30 мин помещают в стеклянную
колбу Стоппарда. В реакционную смесь добавляют 0,9 мл 1 М Na2CO3 и 5 мл
193
0,1 Н раствора йода. Через 20 минут реакционную смесь подкисляют 2 мл 2 М
H2SO4. Титруют остаточный йод 0,1 Н тиосульфатом натрия. Повторите тот
же процесс с определенными интервалами в 30 минут на инкубируемой смеси
в течение 2 часов, чтобы оценить количество редуцирующих сахаров,
выделяющихся при продлении инкубационного периода.
Запишите результаты титрования через определенные промежутки
времени. Вычислите эквивалентные восстановительные группы милле,
освобожденные из полипектата натрия, по стандартной кривой, полученной из
глюкозы, поскольку и моногидрат галактуроновой кислоты, и глюкоза имеют
одинаковое значение.
Экспрессируют активность ПГ в милле-эквивалентах редуцирующих
групп из полипектата натрия/мин/мл ферментного экстракта/фильтрата или мг
белка.
23.3.2.4. Анализ пектиновых трансиминаз (PTE, PATE)
Пектиновые транселиминазы (пектин-транслиминаза или пектиновая
лиаза [ПТЭ] и полигалактуронаттранселиминаза [ПГТ или ПАТЕ]) вызывают
негидролитическое расщепление пектиновых веществ путем удаления атома
Н+ в положении С-5 цепи галактуроновой кислоты, что приводит к
образованию двойной связи между С-4 и С-5 и удалению одной ненасыщенной
моноуроновой кислоты и гомологичного ряда олигоуронидов.
Транселиминазы действуют в щелочном рН (7,0–7,2) по сравнению с ПГ и
ПМГ, которые функционируют в диапазоне рН 4,4–5,6. Ферментный экстракт
или культуральный фильтрат следует диализировать при рН 8,7 в 0,01 М ТрисHCl буфере.
Пектиновая трансэлиминаза (Pectin Lyase, PTE): Фермент Пектиновой
трансэлиминазы вызывает негидролитическое расщепление пектина,
высвобождая ненасыщенные галактуроновые кислоты. Активность этого
фермента можно оценить по потере вязкости пектина ТБА.
Метод TBA (Тиобарбитуровой кислоты)
Необходимый материал
194
Сырой фермент (экстракт или культуральный фильтрат), 1% пектин
(приготовленный методом вязкости), 0,01 М тиобарбитуровая кислота, HCl (0,5
Н, 1 Н), 9% ZnSO4, 7H2O, 0,5 Н NaOH, дистиллированная вода, пипетки (5 мл,
100 мл), 100-мл мензурка, мерный цилиндр (100 мл), пробирки, водяная баня
(100°С), спектрофотометр/калориметр.
Методика
Приготовьте реакционную смесь субстрата, буфера и фермента в
соотношении 4:1:2 в пробирке. Приготовьте еще одну смесь субстрата, буфера
и кипяченого фермента (контроль).Инкубируйте обе пробирки при
температуре 30°C в течение 2 часов. Добавьте по 1 мл ZnSO4, 7H2O и 0,5 Н
NaOH в обе пробирки, чтобы остановить действие фермента и осаждать
ферментный белок и избыток субстрата. Пипетка 5 мл реакционной смеси в
пробирку, содержащую 5 мл реагента ТБА (3 мл ТБА, 1,5 мл 1 Н HCl и 0,5 мл
дистиллированной воды). Поместите пробирку на кипящую водяную баню на
40 минут, чтобы дать возможность проявиться розовому цвету. Дайте трубке
остыть до комнатной температуры. Измерьте поглощение раствора против
контроля между 450 и 575 нм на спектрофотометре.
Наблюдайте за трубкой, которую держат на кипящей водяной бане, для
развития розового цвета. Максимальное поглощение раствора будет при 547
нм; поглощение света при этом нм указывает на наличие активности ПТЭ.
Полигалактуроназа трансэлиминаза (PGTE): Полигалактуроназа
трансэлиминаза (PGTE) или пектиновая кислота трансэлиминаза (PATE)
вызывает негидролитическое расщепление (т. е. трансэлиминационное
расщепление пектиновой кислоты с высвобождением ненасыщенных
галактуроновых кислот). Активность ПГТЭ проверяется различными тестами
(методами вязкости и ТБА), используемыми для ПТЭ, с использованием
полипектата натрия или пектиновой кислоты в качестве субстрата вместо
пектина.
23.3.3. Анализ пектолитической активности Erwinia carotovora
195
Необходимый материал
Блендер Варинга, колба 200 мл, алюминиевая фольга, стерильные
пластины Петри, среда полипектата натрия, культура Erwinia carotovora var.
Zeae.
Методика
Добавьте 4,5 мл (1 Н) NaOH, 3,0 мл (10%) CaCl22H2O,1,5 г агара Difco,
1,0 г NaNO3 и 0,05 г дрожжевого экстракта Difco в 300 мл кипящей воды и
смешайте на высокой скорости в стерилизованном горячей водой блендере.
Добавьте 15 г полипектата натрия и медленно перемешайте, добавляя 200 мл
кипятка. Поместите в 2-литровую колбу и закройте крышкой из алюминиевой
фольги. Автоклав при давлении 15 фунтов в течение 25 минут. Позвольте
давлению медленно падать, чтобы избежать пузырьков. Налейте тарелки как
можно скорее. Среду нельзя снова растопить на водяной бане. Поместите
разбавленную бактериальную суспензию на разлитую затвердевшую среду и
инкубируйте при температуре 25°C.
Пектолитические организмы образуют в полипектатной среде глубокие
круглые углубления.
23.3.4. Определение продукции пектиновых ферментов Xanthomonas
malvacearum
Необходимый материал
Вязкостемер; пипетки; секундомер; 1%-ный раствор пектина в
фосфатном буфере, рН 5,0; 0,5%-ный раствор пектинола 100 Д в воде;
культуральный фильтрат 36-часовой культуры X. malvacearum, выращенной на
питательном бульоне + 0,5% пектина или пектиновой кислоты.
Методика
Тщательно смешайте 1 мл воды с 10 мл раствора пектина, добавьте 6 мл
этой смеси в вязкомер и определите время с помощью секундомера, чтобы этот
препарат протекал через вязкомер через 5 и 20 минут после добавления воды.
Определите также время потока для сопоставимой пробы воды. Прокипятите
небольшую пробу раствора пектинола 100 D осторожно в течение 5 минут и
196
добавьте в раствор пектина. Тщательно смешайте 1 мл пектинола 100 D
(предварительно не нагретого) с 10 мл раствора пектина и добавьте 6 мл этой
смеси в вязкомер. Время прохождения пробы через измеритель вязкости
регистрируют через 0, 5, 10 и 20 минут после добавления пробы фермента в
раствор пектина.
Повторите вторую и третью процедуры с пектиновым раствором,
используя культуральный фильтрат X. malvacearum вместо пектинола 100 D.
Постройте кривую, показывающую изменение вязкости пектинового раствора
со временем, и оцените активность бактериального ферментного препарата
относительно таковой коммерческого препарата. Процент снижения вязкости
можно рассчитать по следующей формуле:
(T0-T1)/(T0-Tw)x100
где To-время потока сразу после добавления ферментного экстракта, Tt-время
потока после заданного интервала времени, а Tw-время потока воды.
Примечание: Пектинол 100 D содержит смесь фермента полигалактуроназы.
Ферментные препараты инактивируют кипячением. Активный ферментный
препарат значительно снижает вязкость пектинового раствора за короткое
время. Считается, что ферменты, продуцируемые фитопатогенными
бактериями, играют определенную роль в разрушении тканей хозяина.
23.4. Выделение бактериоцина
Бактериоцины определяются как белковые антибактериальные вещества,
продуцируемые бактериальными видами, которые ингибируют изоляты одного
и того же вида или близкородственных видов. Химический состав этих
белковых ингибиторных молекул отличает их от других классических
антибиотиков. Исследования продукции бактериоцинов растительными
патогенами нашли применение при типировании видов бактерий и в качестве
средства биологического контроля. Несмотря на то, что бактериоцины обычно
производятся в значительных количествах в обычных средах, использование
индуцирующего агента может улучшить их производство.
23.4.1. Производство бактериоцинов
197
Методика 1
Протокол, описанный lavermicocca et al. (1999), выглядит следующим
образом.
Для получения бактериоцина могут быть использованы следующие
среды: NBY (Smidt and Vidaver, 1986); Среда Вулли (Woolley-Peptone added
with Bacto-Peptone [Difco]), 15 г l−1); или бульон картофеледекстрозы–
казаминовые кислоты (PDB–CA), то есть PDB (Difco), дополненный Бактоказаминовыми кислотами (Difco), 4 г l−1.
Добавьте бактериальную суспензию Pseudomonas syringae ciccaronei (200
мкл; A600 нм, 0·3) в 250-мл Эрленмейеровские колбы, содержащие 100 мл
воды. Встряхните культуры (100 об / мин−1) при температуре 26°C. Каждые 24
часа в течение 7 дней из культур отбирают аликвоты (1 мл), центрифугируют
(9000 г, 10 минут, 4°C) и стерилизуют фильтром (ацетат целлюлозы 0·45 мкм,
Millipore Corp., Бедфорд, Массачусетс).
Количественный анализ
Для количественной оценки продукции бактериоцина в фильтратах
культуры используют агаровый точечный анализ. Определение титров
бактериоцина методом количественного серийного разведения. Точечные
двукратные последовательные разведения Пс. фильтрат культуры syringae
ciccaronei (10 мкл) на поверхность пластин KB агара высевали индикаторным
штаммом Ps. Syringae subsp. савастанои ПВБа204. После 24 часов инкубации
при 26°С ингибирование роста индикаторного штамма выражается в
произвольных единицах (AU) активности, то есть количество бактериоцина в
конечном разведении будет полностью ингибировать рост тест-штамма в
области нанесения 10 мкл капли.
Методика 2: Производство и очистка бактериоцина
Выращивают Pseudomonas syringae ciccaronei штамм NCPPB2355 в 1 л
колбах Эрленмейера, содержащих 400 мл WP. Используйте бактериальную
198
суспензию (A600nm, 0·3; 800 мкл на колбу) в качестве инокулятов. Через 4 дня
инкубации в взбалтанной культуре (100 об / мин−1, 26°С) удаляют клетки
центрифугированием (9000 г, 10 мин, 4°С) и надосадочную жидкость
фильтруют-стерилизуют. Антимикробную активность препарата определяют в
отношении индикаторного штамма Ps. Syringae subsp. savastanoi PVBa204,
используя агаровый точечный анализ. Осадите культуральный фильтрат (1800
мл) сульфатом аммония (66% мас.насыщения) и храните в течение ночи при
температуре 4°C. Удаляют осадок и поверхностные пелликулы
центрифугированием (12000 г, 20 мин, 4°С), ресуспендируют в трисфосфатном буфере (0·01 моль л−1, рН 6·5; 1/10 от исходного объема) и
диализируют против того же буфера в течение 48 часов при 4°С с несколькими
изменениями (диализная трубка, пористость 24, отсечка 17 кДа; Union Carbide
Corporation, Danbury, Коннектикут).
Диализированный осадок, обозначенный как сырой бактериоцин,
последовательно ультрафильтровывается через серию мембран Spectra/Pore
(Spectrum Medical Industries, Laguna Hills, Калифорния) с уменьшающимися
размерами пор (300, 100, 50 и 20 кДа). Запишите объемы и антимикробную
активность ретентатов и фильтратов. Ретентат, выделенный из
ультрафильтрации 100 кДа, лиофилизуют, а остаток (1,20 г) растворяют в 6 мл
сверхчистой воды Milli-Q и наносят на тонкую колонку Sephadex G-150
(Pharmacia, Uppsala, Швеция; 4,5 × 40 см; расход 2,5 мл мин−1). Соберите
колонные фракции (по 7 мл каждая) в однородные группы в соответствии с u.v.
диаграммой, полученной путем мониторинга при 267 нм, максимуме
поглощения ультрафильтрованного сырого бактериоцина. Лиофилизируют
фракции и вкусовые качества на содержание белка и антимикробную
активность в отношении индикаторного штамма.
Электрофорез (Аналитический гель-электрофорез): Восстановление
неденатурирующей разрывной СТРАНИЦЫ наиболее активной фракции из
гель-фильтрации (фракция IV), выполненной по методу Гросса и ДеВая (1977)
с незначительными модификациями, в 7,5-процентном (w/v) разрывном геле с
199
помощью системы электрофореза Mini-Protean II (BioRad Laboratories,
Hercules, California). Используйте бычий сывороточный альбумин (BSA;
Sigma) в качестве белкового маркера. Запускают образцы при постоянном
напряжении 200В 1мм−1гель в течение 1 часа. После электрофореза разрежьте
гель пополам, оставив одинаковые маркерные и пробные полосы на каждой
половине. Одну половину окрашивают Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma), а
другую промывают в деионизированной воде в течение 20 минут с частыми
изменениями, укладывают на пластины KB-агара и накладывают мягкий KBагар (0,7% w/v), засеянный индикаторным штаммом (Bhunia et al., 1987).
Инкубируйте пластину в течение ночи при температуре 26°C. После роста
индикаторного штамма расположение гало(ов) ингибирования на
неокрашенном геле коррелирует с белковой полосой(ов) на окрашенном геле.
Препаративная СТРАНИЦА: Условия приготовления геля и
электрофореза должны быть такими же, как и описанные для аналитической
СТРАНИЦЫ. Ресуспендируйте 5 мг образца фракции IV в 200 мкл
дистиллированной воды и нанесите на гель. После электрофореза окрашенную
полосу с Рч, соответствующую расположению гало ингибирования в
неокрашенной полосе, вырезают из геля лезвием бритвы. Извлекают белковую
полосу с помощью микропорошкового сепаратора 0,22 мкм, расположенного в
центробежном микроконцентраторе Microcon-30 (Amicon, Беверли,
Массачусетс) в соответствии с инструкциями производителя.
SDS-PAGE: Анализ белка, выделенного из препаративного геля с
помощью SDS-PAGE, выполнялся в соответствии с описанием Laemmli (1970).
Белковые стандарты и их молекулярные массы включают следующие:
Тимоглобулин-330 кДа; ферритин (половина единицы) - 220 кДа; альбумин-67
кДа; катализаторы-60 кДа; лактатдегидрогеназа-36 кДа; ферритин-18,5 кДа
(Фармация).
Оценка белка и антимикробной активности: Определяют концентрацию
белка в образцах либо по методу Брэдфорда (1976), либо с помощью набора
Bio-Rad (Bradford) Low Protein Assay Kit. Используйте бычий сывороточный
200
альбумин фракции V (Merck) в качестве стандарта белка. Анализ
антимикробной активности препаратов бактериоцина в агаровом пятнистом
анализе против Пс. Syringae subsp. штамм савастанои PVBa204.
23.4.2. Химическая и физическая стабильность бактериоцина
Обработайте аликвоты (1 мл) сырого бактериоцина (3200 AU мл−1)
следующими ферментами (Сигма): Протеиназой К, протеазой, трипсином, а–
химотрипсином, фицином, липазой и а–амилазой. Проводят анализы при
конечной концентрации 1 мг мл−1ат рН 6,5. Выдерживают образцы с
ферментами и без них при соответствующей температуре (в зависимости от
ферментов) в течение 1 часа.
Для проверки стабильности при различных температурах и значениях рН
сырые аликвоты бактериоцина (1 мл, 3200 AU ml−1, рН 6,5) доводят до
значений рН в диапазоне от 2,0 до 10,0 с 1 моль l−1HCl или NaOH и
выдерживают в течение 1 часа при 25 и 50°C и в течение 15 минут при 60 и
100°C, затем быстро охлаждают и возвращают к исходному значению рН.
Для проверки влияния органических растворителей на стабильность
сублимированные сырые аликвоты бактериоцина (1 мл; 3200AU мл-1)
обрабатывают различными органическими растворителями, такими как
формальдегид (10% в/в), хлороформ (10% в/в), ацетон (10% в/в), изопропанол
(10% в/в), этиловый спирт (25% в/в), ацетонитрил (70% в/в) и гексан (25%);
выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем растворители
испаряются под вакуумом. Высушенные образцы восстанавливают стерильной
дистиллированной водой.
После каждой обработки образцы должны быть проанализированы на
антимикробную активность в отношении индикаторного штамма Ps. Подвид
Syringae. штамм савастанои PVBa204.
Способ действия
Изучить механизм действия бактериоцина, жизнеспособность и лизис
чувствительных клеток Ps. Подвид Syringae. исследован штамм савастанои
PVBa229. Разведите ночную культуру штамма до одной десятой в свежей среде
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]