Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
171
Методика
1. выращивайте бактериальные культуры в 2,5 мл среды в течение ночи:
обратно разведите культуры 1:100 в 250 мл свежей среды и вырастите до 0,7–
0,8 OD при 600 Нм. Приготовьте раствор 6-процентного додецилсульфата
натрия (SDS) в воде. Внимание: порошок SDS опасен; избегайте вдыхания
порошка SDS и надевайте маску на нос и рот.
2. День 1: Лизирование бактериальной культуры проводят в течение
одного дня и ночи: пока разведенные культуры растут, поставьте воду
кипятиться в 1-литровом стакане. Когда на горячей плите и магнитной мешалке
вода закипит, приготовьте аликвоту из 6 мл 6-процентного SDS в 50 мл
полипропиленовых трубок и добавьте по одной маленькой мешалке в каждую
трубочку. Плотно закрепите крышку трубки пальцем, поместите трубки в
кипящую воду и включите перемешивание до 500 об / мин на горячей плите.
Собирают 250 мл культур при 5000 × г в течение 10 мин при комнатной
температуре и ресуспендируют гранулы в 3 мл среды или 1× фосфатного
буферного физиологического раствора. Медленно пипетируйте клеточную
суспензию в 50 мл пробирки с 6-процентным кипящим SDS для лизиса клетки
(конечная концентрация 4% SDS), пока пробирки погружены в кипящую
водяную баню, и снова закройте крышку, чтобы плотно сжать палец.
Примечание: клеточная суспензия должна быть быстро перенесена в
кипящий SDS после ресуспендирования.
Следует избегать резких изменений окружающей среды, так как это
может привести к ошибочному изменению структуры клеточной стенки.
Накройте стакан кипятком и дайте клеткам закипеть в течение 3 часов,
периодически проверяя уровень воды и при необходимости снова наполняя
стакан водой. Через 3 часа выключите нагревательный элемент нагревательной
плиты, но продолжайте перемешивать в течение ночи при 500 об / мин.
3. день 2: ферментативное пищеварение осуществляется в течение 1 дня:
Если SDS осаждается в пробирках по 50 мл в течение ночи, доведите воду до
кипения еще на 1-2 часа. Включите тепловой блок до 60°C. Приготовьте 1
172
мг/мл запаса проназы Е в 10 мл Трис-HCl (рН 7,2) + 0,06% w/v NaCl и
активируйте Проназу Е при температуре 60°C в течение не менее 30 минут.
Используйте ультрацентрифугу, установленную на 400000 × g, для отжима
образцов в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать
крупные полимеры PG и тем самым очистить их от других клеточных
компонентов. Тщательно удалите супернатант, а затем ресуспендируйте
каждую гранулу при комнатной температуре в сверхчистой воде.
Примечание: объем Ресуспензии зависит от объема используемой
ультрацентрифужной трубки; используйте объем, который заполняет трубки
по крайней мере наполовину, но не превышает максимального объема трубок.
Повторите центрифугирование/промывку до тех пор, пока вода не
образует пузырьков во время ресуспензии, что указывает на то, что SDS был
полностью удален (обычно три промывки), и теперь прекратите промывку
гранулы. Если образуется белый осадок, это указывает на то, что мешочки
слипаются вместе. Комкование не является катастрофическим, но комки очень
сильно связываются с пластиком и стеклянной посудой, вызывая большие
потери образца. В этом случае приступайте к протоколу, используя образец
сгущенных мешочков. На последней стадии центрифугирования/промывки
ресуспендируйте образец в 900 мкл 100 мм Трис-HCl (рН 7,2) + 0,06% w/v NaCl
и перенесите в пробирки объемом 2 мл, предварительно проткнутые
Повторите центрифугирование/промывку до тех пор, пока вода не
образует пузырьков во время ресуспензии, что указывает на то, что SDS был
полностью удален (обычно три промывки), и теперь прекратите промывку
гранулы. Если образуется белый осадок, это указывает на то, что мешочки
слипаются вместе. Комкование не является катастрофическим, но комки очень
сильно связываются с пластиком и стеклянной посудой, вызывая большие
потери образца. В этом случае приступайте к протоколу, используя образец
сгущенных мешочков. На последней стадии центрифугирования/промывки
ресуспендируют образец в 900 мкл 100 мм Трис-HCl (рН 7,2) + 0,06% w/v NaCl
и переносят в 2 мл пробирки, предварительно проколотые с отверстиями в
173
вершинах небольшой иглой. Добавьте 100 мкл 1 мг/мл активированной
проназы е (конечная концентрация 100 мкг/мл) к каждому образцу и
инкубируйте при 60°С в течение 2 часов. Получите другой тепловой блок до
100°C. Остановите переваривание проназы е, добавив 200 мкл 6% SDS к
каждому образцу и прокипятите образцы в термоблоке 100°C в течение 30
минут. Получите другой тепловой блок до 37°C и сделайте 1 мг/мл запаса
мурамидазы (мутанолизина) в 50 мм фосфатном буфере (рН 4,9). Как и на
предыдущем этапе, используйте ультрацентрифугу, установленную на 400000
× g, чтобы отжать образцы в течение 20 минут при комнатной температуре и
промыть их сверхчистой водой комнатной температуры до полного удаления
SDS (обычно три промывки). Объем ресуспензии зависит от объема
используемой ультрацентрифужной трубки; используйте объем, который
заполняет трубки по крайней мере наполовину, но не превышает
максимального объема трубки. На последней стадии
центрифугирования/промывки образцы ресуспендируют в 200 мкл 50 мм
натрий-фосфатного буфера (рН 4,98). Этот объем можно регулировать в
соответствии с количеством пептидогликана (ПГ) в образце и может зависеть
от вида. Если имеются ранее опубликованные отчеты о ВЭЖХ-анализе для
интересующих видов, то этот объем может быть оценен на основе этих
количественных показателей (компиляцию исследований HPCL PG можно
найти в разделе справочная информация). Для других видов препарат sacculus
может быть выполнен до этого этапа, а затем различные количества объемов
ресуспензии могут быть добавлены к реплицированным образцам, чтобы
определить минимальный объем, который позволяет PG оставаться в растворе.
Если образец содержит больше пептидогликана, увеличьте объем ресуспензии;
если образец содержит мало пептидогликана, уменьшите объем ресуспензии до
минимума 50 мкл. Перенесите образцы в пробирки по 1,5 мл и добавьте 1 мг/мл
мурамидазы, чтобы получить конечную концентрацию 40 мкг/мл.
Инкубировать 6-8 часов или ночь при температуре 37°C.
174
4. 3-й день: подготовка образца для UPLIC производится в последний
день: включите тепловой блок до 100°C. Кипятите образец без SDS в течение 5
минут, чтобы остановить переваривание мурамидазы. Центрифугируйте
образцы в течение 10 минут при 16000 × g при комнатной температуре, затем
перенесите супернатант (муропептиды теперь растворимы) в стеклянные
трубки размером 13 мм × 100 мм. Постарайтесь извлечь как можно больше
супернатанта, подобравшись очень близко к грануле, не потревожив ее.
Отрегулируйте рН, добавив 500 мм боратного буфера (рН 9) к образцу для
конечной концентрации 100 мм боратного буфера. Боратный буфер совместим
с восстановителем боргидридом натрия. Добавьте от одного до двух зерен
боргидрида натрия, чтобы уменьшить каждый образец, и дайте реакции
продолжаться не менее 30 минут при комнатной температуре.
Внимание: Боргидрид натрия обладает высокой реакционной
способностью и опасен в обращении. Избегайте контакта с кожей (наденьте
перчатки) и глазами (наденьте защитные очки).
Отрегулируйте образец до рН 3-4 (изоэлектрическая точка муропептида
равна 3,5) с помощью 50-процентной Вт/в ортофосфоновой кислоты с шагом
20 мкл до рН 6, измеренного с помощью индикаторной бумаги рН, а затем с
шагом 2 мкл.
Внимание: ортофосфорная кислота вызывает коррозию и опасна в
обращении. Избегайте контакта с кожей и глазами.
Образец должен пузыриться в ответ на добавление ортофосфорной
кислоты; когда образец перестает пузыриться, это обычно указывает на то, что
был достигнут рН 6. Если в образце не происходит барботажа, это может
свидетельствовать о том, что добавленное количество борогидрита натрия
было слишком маленьким. В этом случае прекратите снижение рН, осторожно
добавьте одно или два зерна борогидрита натрия, дайте ему прореагировать в
течение 5-10 минут, затем возобновите регулировку рН. Образец фильтруют
через 0,22 мкм фильтр шприца непосредственно в пробирку ГЗК. Если осадок
образовался, нагрейте трубку с несколькими проходами через пламя перед
175
фильтрованием. Если образец не будет введен в прибор UPLC в течение дня,
заморозьте его на ночь при температуре -20°C. Образцы могут храниться до
года при температуре -80°C. Образец можно разморозить, пропуская через
пламя несколько раз. Впрысните 10 мкл каждого образца на прибор UPLC,
оснащенный колонкой обратной фазы C18 1,7 мкм и детектором поглощения,
установленным для контроля 202-208 часов. Образцы вводятся
последовательно, но возможности автоматической выборки позволяют
обрабатывать до 96 образцов в одной партии. Используйте 50 мм фосфат
натрия (рН 4,35) + 0,4% в/в азид натрия для растворителя а и 75 мм
натрийфосфат (рН 4,95) + 15% в/в метанол для растворителя В.
Примечание: азид натрия добавляется для компенсации поглощения
метанола 205 Нм, чтобы избежать дрейфа базовой линии. Доведите расход до
0,25 мл/мин и используйте линейный градиент в течение 25 минут для
достижения 100-процентного растворителя В и последовательного
элюирования муропептидов в течение 30 минут. Если масс-спектрометрия
будет использоваться для характеристики муропептида после УПЛК, соберите
и высушите фракции с помощью центробежного испарителя.
22.2. Выделение бактерий без клеточной стенки (L-форма)
Морфология бактерий определяется клеточной стенкой. Поскольку Lформа не имеет клеточной стенки, ее морфология отличается от морфологии
штамма бактерий, из которого она получена. Типичными клетками L-формы
являются сферы или сфероиды.
Хотя L-формы могут быть разработаны из грамположительных и
грамотрицательных бактерий, при окрашивании по Граму он всегда тестирует
грамотрицательные, из - за отсутствия клеточной стенки. Они размножаются
почкованием, то есть расширением тонких выступов с поверхности клеток, а
затем эти выступы отщипываются, образуя новые клетки.
Методика
L-формы могут быть получены в лаборатории для многих видов
бактерий, которые обычно имеют клеточные стенки.
176
Это делается путем ингибирования синтеза пептидогликанов
антибиотиками или обработки клеток лизоцимом, ферментом, который
переваривает клеточную стенку.
Готовят питательные агаровые пластинки из различных концентраций
пенициллина. Стрик бактериальный налет и инкубировать при 28 ± 2°C
рабочая температура в течение 5-7 дней. Наблюдайте за пластинками для
развития бактериальных колоний без клеточной стенки.
Колонии бактерий без клеточных стенок похожи на омлеты из яицпашот.
Примечание: ни одна бактерия без клеточной стенки еще не
зарегистрирована в качестве патогена растений.
22.3. Выделение бактериального экзополисахарида (EPS)
Методика
Выращивают бактериальную культуру в среде получения
экзополисахаридов (K2HPO4, 1,2 г; KH2PO4, 0,8 г; MgSO4. 7H2O, 0,2 г;
пептон, 5 г; сахароза, 5 г; дистиллированная вода, 1 л; рН, 6-8) в течение пяти
дней при температуре 30-32°C на вращающемся шейкере. Удалите
бактериальную клетку центрифугированием при 15000 об / мин в течение 15
минут и соберите культуральный фильтрат. Добавьте N-цетилпиридиния
хлорид (моногидрат) в количестве 2 г на Л фильтрата культуры и дайте
постоять для осаждения экзополисахарида. Добавьте одну или две гранулы
гидроксида калия, чтобы ускорить процесс осаждения. Осадок удаляют
центрифугированием и растворяют в необходимом количестве 10% NaCl в
зависимости от объема осадка. Повторно осаждают ЭПС двумя объемами
этанола. На этой стадии ЭПС появляется в виде густого геля, который плавает
сверху и не оседает легко. Осторожно снимите ЭПС с помощью изогнутого
стеклянного стержня.
Растворите снова в дистиллированной воде и повторно осаждайте
этанолом. Наконец, промыть петролейным эфиром, высушить под вакуумом и
хранить в течение ночи над хлоридом кальция в эксикаторе. Приготовьте
177
порошок ЭПС в стерильном пестике и ступке и храните в морозильной камере
при температуре 4°С для дальнейшего использования.
22.3.1. Испытание EPS йодным тестом
Необходимый Материал
Суспензия полисахаридов, разбавленная HCl, раствор йода.
Методика
Возьмите 2 мл суспензии полисахарида (1 мг на мл полисахарида).
Подкислить двумя каплями разбавленного HCl (0,1 Н). Добавьте две капли
раствора йода и наблюдайте за развитием цвета.
Присутствие крахмала в ЭПС дает синий цвет, в то время как присутствие
гликогена в ЭПС дает красно-коричневый цвет (основное содержание ЭПСгликоген).
22.3.2. Оценка ЭПС
Измерьте количество ЭПС в мг/л фильтрата бактериальных клеток для
индивидуальной бактериальной культуры, расы или патогена.
22.3.3. Оценка содержания сахара в ЭПС
Оцените общее содержание сахаров в ЭПС методом Антрона (Dubois et
al., 1951).
Раствор и реагенты
Антронный реагент, 2 г/л кон H2SO4, стандартный сахар глюкоза 100
мкг/мл.
Методика
Растворите ЭПС (10 мг/мл) в дистиллированной воде. Добавьте 4 мл
антронного реагента к 1 мл тестового раствора ЭПС и быстро перемешайте.
Поместите трубки на кипящую водяную баню на 10 минут с мрамором сверху,
чтобы предотвратить потерю воды при испарении. Охладите и считайте
экстинкцию при 620 Нм против заготовки реагента. Оцените концентрацию
сахара по стандартной кривой, полученной с известным количеством глюкозы.
22.3.4. Оценка содержания белка в ЭПС
Вариант 1
178
Необходимые Материалы
ЭПС, сверхчистая вода, спектрофотометр.
Методика
Приготовьте 1/10, 1/20, 1/40 и так далее разведение 1 г ЭПС в
сверхчистой воде и считайте экстинкцию при 280 Нм. Рассчитайте количество
белка в образце, используя следующую формулу:
Вариант 2
Необходимые Материалы
ЭПС, сверхчистая вода, реагент, спектрофотометр.
Методика
К 1 мл исследуемого раствора добавляют 5 мл раствора е, встряхивают
пробирки и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут.
Добавить 0,5 мл реактива Фолина 1 н в каждую пробирку и взболтать.
Инкубируйте пробирки при температуре 30°C в течение 30 минут и считайте
экстинкцию при 750 Нм. Рассчитайте белок по стандартной кривой альбумина
(используйте 0-100 мкг альбумина на мл для получения стандартной кривой).
22.4. Выделение бактериального липида
Был широко распространен интерес к анализу липидных профилей
бактерий для таксономической идентификации, поскольку вариации
липидного профиля внутри патогенов действительно выходят. За последнее
десятилетие значительная часть масс-спектрометрических исследований
бактерий была сосредоточена на пептидах и белках внутри клетки. В цельной
клетке матричный лазерный десорбционно-ионизационный анализ (MALDI)
дает характерный пептидный отпечаток пальца, специфичный для данной
бактерии, позволяющий дифференцировать бактерии по роду, виду и даже
штамму.
Метод, рекомендованный Льюисом и др. (2000) для извлечения липидов
из одноклеточных организмов, таких как бактерии, заключается в следующем.
Методика 1
179
Выращивайте бактерии в питательном бульоне в течение 3 дней.
Собирают бактериальные клетки с помощью высокоскоростного
центрифугирования в течение 15 минут. Отбросьте супернатант и
ресуспендируйте гранулу в 100 мл 1,0% NaCl (w/v) и рецентрифугируйте.
Сбросьте супернатант и соберите клеточную гранулу для замораживания в
течение ночи при температуре -30°C.
Замораживание-высушите замороженную биомассу в течение 15 часов и
храните в закрытой стеклянной таре при температуре -30°C. К замороженным
клеткам (около 100 мг) добавляют ¼ мл растворителя в последовательности:
хлороформ, метанол и вода для достижения конечного соотношения
хлороформ/метанол/вода 1:2:0,8 (V/V/V). Встряхните образцы в течение 15
секунд сразу после добавления каждого растворителя и дайте постоять около
18 часов, периодически встряхивая вручную. Проводят фазовый сепаратор
смеси биомасса–растворитель в разделительной воронке путем добавления
хлороформа и воды для получения конечного соотношения
хлороформ/метанол/вода 1:1:0,9 (v/v/v). Известная часть каждого общего
липидного экстракта, выделенного из нижней хлороформной фазы, может быть
использована для дальнейшего анализа.
Примечание: Если требуется только определение жирных кислот, то
эффективным является прямое омыление с использованием кон в этаноле.
Аналогичным образом, система растворителей гексан–изопропанол оказалась
эффективной для бактерий bacteriapseudomonas (Guckert et al., 1988).
Методика 2
Выращивайте бактерии в питательном бульоне в течение 3 дней и
собирайте бактериальные клетки центрифугированием при температуре 4°C.
Дважды промойте гранулу ледяным 75 - процентным этанолом. Для
извлечения липида в бактериальной клетке клетки смешивают с 30 мл смеси
1:1:1 (v/v/v) дихлорметана, этанола и воды. Взбейте смесь в течение 1-2 минут
и дайте постоять всю ночь. В результате образуется двухфазная система с
нижним органическим слоем, содержащим липиды. Затем этот слой
180
переносится пипеткой в другую емкость, и растворитель испаряется под азотом
до тех пор, пока не останется примерно 1 мл. 1 мкл липидного экстракта затем
смешивают с 1 мкл 1 м 2,5 дигидроксибензойной кислоты (ДБН; в 90 процентном метаноле с 0,1 - процентной муравьиной кислотой) и нанесен на
мишень MALDI.
22.4.1. Определение бактериальных липидов
Масс-спектры могут быть получены на масс-спектрометре ultra-flex II
MALDI-TOF/TOF, оснащенном твердотельным лазером smartbeam (Bruker
Daltonics Bremen, Германия), работающим в режиме ретракции
положительных ионов. Мощность лазера регулируется до точки, немного
превышающей порог ионизации образца, и выстреливается со скоростью 10 Гц
с накоплением 1000-1500 лазерных выстрелов за один скан. Для каждого вида
бактерий необходимо получить от пяти до восьми реплицированных образцов.
Необходимо получить от трех до пяти масс-спектров и усреднить их для
каждого отдельного образца с помощью 1000-1500 лазерных выстрелов,
нанесенных по всему пятну мишени MALDI. Для проверки изменчивости
спектров относительная интенсивность данного пика вычисляется в процентах
от суммы 10-15 самых высоких пиков интенсивности в спектре. Для
выборочных повторов средняя относительная интенсивность данного пика
изменяется менее чем на 5%.
Результаты масс-спектров экстракта, проанализированного методом
матрично-ассистированной лазерной десорбции/ионизации света (MALDI—
TOF) масс-спектрометрии и тандемной масс-спектроскопии TOD, показывают
ряд пиков, соответствующих натриевым фосфолипидам-в первую очередь
фосфатидилэтаноламину (PE) и фосфатидилглицерину (Ph). Относительное
количество фосфолипидов и составов жирных кислот, полученных из спектров,
может быть сопоставлено с ранее сообщенными значениями из исследований
ГХ/МС.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]