Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
381
Центрифугируйте образец при 10 000 об/мин в течение 4 минут при
температуре 18 °C для очистки. Перенесите супернатант во флаконы для
анализа GC-MS.
III. Инъекция образца
Доведите начальную температуру духовки до 50 °C. Трижды промойте
шприц соответствующим растворителем, а именно: этилацетат из экстракта
этанола и в метаноле для экстракта метанола. Его снова трижды промывают
образцом перед введением образца. Введите 2 мкл объема пробы в колонку GC-
MS.
IV. Обнаружение соединения
Запустите полное сканирование образца с программированием
температуры 280 °C, то есть 36 минут. Проведите качественный анализ
соединения, присутствующего в образце, по относительному времени
удерживания (RRT) и сравните размер (высоту или площадь) пика. Используя
библиотечный поиск блока GC-MS (NIST MS search 2.0), можно
идентифицировать вероятное соединение.
382
40. ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ МИКРОБОВ
Некоторые микробы, такие как грибы, актиномицеты, дрожжи и
некоторые бактериальные spp., проявляют антагонизм к бактериальным
патогенам растений и поэтому являются важными источниками
антибактериальных микробных агентов.
40.1. Выделение антибактериальных грибов
Необходимый материал
Образец больного растения, образец почвы с разложившимися листьями
в растительном бассейне, пластины питательного агара, заготовка для воды,
пестик и ступка, пластины картофельного агара с декстрозой.
Методика
Шаг 1
Измельчите образец болезни или разложенные больные листья в почве (1
г) в 5 мл стерильной воды. Пипеткой вылейте 0,2 мл мацерата на питательный
агар и пластины картофельного агара с декстрозой отдельно и распределите с
помощью изогнутого стеклянного стержня. Инкубируйте пластины при
температуре 27 ±2 °C в инкубаторе в течение 3 дней.
Наблюдение
Регистрируйте развитие грибковых и дрожжевых колоний наряду с
бактериальными колониями патогенных растений. Пожалуйста, обратите
внимание на ассоциированные колонии грибов или дрожжей с колониями
патогенных бактерий растений. Такие колонии должны быть разделены.
Отделите грибковые и дрожжевые колонии, связанные с бактериями,
соберите их и перенесите на среду с декстрозой картофеля для их роста.
Шаг 2
Подготовьте газон с культурой патогенных бактерий растений, посеяв
питательную агаровую среду с бактериальной культурой. После затвердевания
среды поместите грибковый диск в центр пластины в перевернутом положении
383
с небольшим давлением. Повторите это для каждого грибкового изолята.
Инкубируйте пластины в течение 3 дней.
Наблюдайте за зоной торможения, образованной грибком на
бактериальном газоне. Те грибковые изоляты, которые образуют зону
ингибирования на бактериальном газоне, являются антибактериальными
грибковыми биоагентами.
40.2. Выделение антибактериальных бактерий
Необходимый материал
Образец больного растения, образец почвы с разложившимися листьями
в растительном бассейне, пластины питательного агара, заготовка для воды,
пестик и ступка.
Методика
Шаг 1
Измельчите образец болезни или разложенные больные листья в почве (1
г) в 5 мл стерильной воды. Пипеткой из 0,2 мл размачивают на пластинах
питательного агара и распределяют с помощью изогнутого стеклянного
стержня. Инкубируйте пластины при температуре 27 ±2 °C в инкубаторе в
течение 3 дней.
Наблюдение
Запишите развитие всех бактериальных колоний вместе с
бактериальными колониями патогенных растений. Пожалуйста, обратите
внимание на ассоциированные бактериальные колонии с колониями
патогенных бактерий растений. Такие колонии должны быть разделены.
Отделите сапрофитные бактериальные колонии, связанные с
патогенными растениями, на основе их характеристик, соберите их и
перенесите на питательную агаровую среду для их роста.
Шаг 2
Подготовьте газон с культурой патогенных бактерий растений, посеяв
питательную агаровую среду с бактериальной культурой. После затвердевания
среды поместите бумажный диск, наполненный сапрофитной бактериальной
384
культурой, в центр пластины и слегка надавите на диск. Повторите это для
каждого изолята сапрофитных бактерий. Инкубируйте пластины в течение 3
дней.
Обратите внимание на зону ингибирования, образованную
сапрофитными бактериальными культурами на бактериальном газоне
патогенных бактерий растений. Те сапрофитные бактериальные изоляты,
которые образуют зону ингибирования на бактериальном газоне, являются
антибактериальными бактериальными биоагентами.
40.3. Тестирование антибактериальных свойств микробной культуры
Необходимый материал
Испытайте грибковую/бактериальную культуру, испытайте культуру
патогенных бактерий растений, питательную агаровую пластину, стерильную
колбу, пробную воду, питательный бульон и так далее.
Методика
Приготовьте и стерилизуйте 50 мл питательного бульона в конической
колбе. Приготовьте суспензию тестируемой грибковой/бактериальной
культуры, а также культуры патогенных бактерий растений (0,1 ЕД) в
стерильных условиях. Добавьте 0,5 мл тестовой микробной культуры и 0,5 мл
тестовой культуры патогенных бактерий растений в питательный бульон,
перемешивайте в шейкере в течение 10 минут и инкубируйте при 27 ±2 °C в
инкубаторе в течение 5 дней. Возьмите из этого суспензию с петлей и нанесите
на пластины с питательным агаром. Инкубируйте эти пластины при
температуре 27 ±2 °C в инкубаторе в течение 48 часов, чтобы наблюдать за
развитием и ростом патогенных бактерий исследуемых растений.
Понаблюдайте за пластинами на наличие и рост тест-бактерий,
патогенных для растений. Отсутствие колоний патогенных бактерий растений
в пластине указывает на антибактериальные свойства тестируемого
грибкового/бактериального биоагента.
385
40.4.1. Массовое производство на базе носителя
Необходимый материал
Питательный бульон, антибактериальная культура, вращающиеся
шейкеры, инкубаторы, порошок талька.
Методика
Выращивайте антибактериальную культуру в питательном бульоне в
необходимых количествах в течение 4-5 дней, инкубируя поочередно на
вращающемся шейкере и инкубаторах при температуре 27±2 °C. Смешайте
выращенную бульонную культуру в порошке талька в соответствующих
количествах, чтобы порошок талька был полностью влажным во время
смешивания раствора. Высушите смесь под навесом, чтобы получить сухой
порошок талька. Протестируйте популяцию антибактериальной культуры в
порошке талька методом последовательного разбавления. Это должно быть 108
кое/грамм порошка. Заполните пакеты и запечатайте их должным образом.
Приготовление препарата на основе носителя для флуоресценции
Pseudomonas: Эффективный штамм Pseudomonas fluorescens, полученный в
результате антагонистического теста, размножают на бульоне King B при 28 ±2
°C в течение 3 дней в инкубаторе. Стерилизовал порошок талька в автоклаве
при температуре 121 °C при давлении 15 фунтов в течение 20 минут. Смешайте
400 мл бульонной культуры флуоресценции Pseudomonas с 1 кг порошка
талька. Равномерно перемешайте и оставьте для сушки в асептическом
состоянии для удаления лишней влаги. Возьмите начальный отсчет и упакуйте
препарат в стерильные полиэтиленовые пакеты. Регулярно проверяйте
жизнеспособность агента биоконтроля pf в носителе.
40.4.2. Массовое производство на жидкой основе
Стандартная жидкая среда для массового производства Pseudomonas
fluorescens: Пептон протеазы, ортофосфат водорода дикалия (K2HPO4),
глицерин, MgSO4.7H2O, трегалоза, арабиноза, фосфовинилпируват.
386
Приготовление стандартной жидкой композиции: Стерилизуют
стандартную жидкую среду и инокулируют эффективным штаммом
Pseudomonas fluorescens в стерильных условиях в конических колбах.
Инкубируйте эти колбы при температуре 28+2 °C на вращающемся шейкере в
течение 8 часов в день в течение 4-5 дней. Удалите колбы после интенсивного
роста бактерий и инкубируйте при 28 °C в течение 1-2 дней. Возьмите
начальный отсчет и храните препарат в стерилизованных пластиковых
бутылках. Регулярно проверяйте жизнеспособность биоконтрольного агента pf
в жидкой форме.
387
41. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БАКТЕРИЦИДНЫХ СОСТАВОВ
Для борьбы с бактериальной инфекцией необходимо подготовить
составы доступных бактерицидов или бактерицидных соединений в виде
спреев или пасты для нанесения против болезни.
41.1. Приготовление бактерицидного спрея
41.1.1. Приготовление бордосской смеси
Необходимый Материал
Медный купорос, известь, вода, пластиковая ванна или бак.
Методика
Растворите 1 кг сульфата меди в 20 л воды в пластиковом контейнере,
хорошо перемешайте и оставьте на ночь. Растворите 1 кг гидратированной
извести в 20 л воды в другой пластиковой емкости, хорошо перемешайте и
оставьте на ночь. Процедите надосадочную жидкость из обоих контейнеров с
двухслойной муслиновой тканью в другой большой контейнер и доведите
объем до 100 л с водой. Это дает 1 процент бордосской смеси. Отрегулируйте
рН бордосской смеси примерно до 7,0 с помощью известковой воды.
Чтобы получить более низкие концентрации бордосской смеси, добавьте
соответствующее количество воды в 1-процентную бордосскую смесь. Для
достижения более высокой концентрации соответствующим образом
увеличьте количество сульфата меди и извести. Приготовленная таким образом
смесь готова к опрыскиванию для борьбы с бактериальными инфекциями на
растении.
41.1.2. Приготовление бактерицидной смеси
Необходимый Материал
Химикат для использования в качестве бактерицида, воды, пластиковой
ванны и так далее.
Методика
Выберите бактерицид или антибиотики, которые будут использоваться
для распыления. Обычно используется 250 частей на миллион, 500 частей на
388
миллион, 1000 частей на миллион или 0,2-процентный раствор бактерицидов
или антибиотиков.
Растворите необходимое количество антибиотика или бактерицида в
воде, как показано в таблице, чтобы получить требуемую концентрацию
бактерицида; хорошо перемешайте. Процедите через двухслойную
муслиновую ткань и используйте для распыления, чтобы контролировать
бактериальную инфекцию на растении.
41.2. Приготовление бактерицидных паст
Бактерицидные пасты обязательно наносятся и используются для борьбы
с бактериальной инфекцией веток, стебля или основного ствола растения.
41.2.1. Приготовление бордосской пасты
Необходимый Материал
Медный купорос, известь, вода, пластиковая ванна.
Методика
Добавьте 450 г сульфата меди и 450 г извести в 3,5 л воды и хорошо
перемешайте, чтобы приготовить пасту.
41.2.2. Приготовление пасты рахури
Это паста на масляной основе, приготовленная профессором Боркаром и
его ученицей Рубиной Покхарель. Паста запатентована в Индии (CBR № 4708
от 27.3.2015) для борьбы с бактериальной инфекцией на веточках и стеблях
граната. Паста также омолаживает зараженные растения, прорастая новыми
побегами на зараженных стеблях.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]