Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
341
фага, как “исходный фаг”. Храните флаконы с бактериофагом в глубокой
заморозке для сохранения фагов.
342
33. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К
АНТИБИОТИКАМ И ПЕСТИЦИДАМ
Бактерии, будучи микроорганизмами, чувствительны к различным
условиям окружающей среды, включая химические пестициды. Химические
пестициды подавляют бактериальный метаболизм, а также влияют на
различные клеточные компоненты бактерий. Чувствительность бактерий к
различным пестицидам определяется различными методами.
33.1. Определение чувствительности бактерий методом отравленной
пищи
Необходимый Материал
Испытайте химикат (антибиотик/бактерицид, пестицид), испытайте
бактериальную культуру, питательную агаровую среду, стерилизованные
пластины Петри, стерильные пипетки, стерильную воду и так далее.
Методика
Добавьте измеренное количество тестируемых химических веществ в
измеренное количество стерилизованной тепловатой питательной агаровой
среды, чтобы получить требуемую концентрацию тестируемого химического
вещества. Вылейте эту отравленную среду в стерильную тарелку Петри и дайте
ей затвердеть. Приготовьте бактериальную суспензию исследуемой бактерии
(0,1 ЕД) и добавьте 0,2 мл в центральную часть пластины и распределите с
помощью стеклянной палочки. Инкубируйте пластину при температуре 27 ±2
°C в инкубаторе в течение 24 часов, чтобы зафиксировать рост бактерии.
Поддерживали не отравленную простую питательную агаровую пластинку,
инокулированную тестируемой бактерией в качестве контроля.
Запишите рост исследуемой бактерии на отравленной среде и сравните с
контрольными пластинами. Отсутствие роста в отравленной среде указывает
на чувствительность исследуемой бактерии к данному химическому веществу
в данной концентрации.
343
33.2. Определение чувствительности бактерий методом дискового анализа
Необходимый Материал
Испытательный химикат (антибиотик/бактерицид/пестицид),
испытательная бактериальная культура, питательная агаровая среда,
стерилизованные пластины Петри, стерилизованная вода, стерилизованный
диск из фильтровальной бумаги № 24.
Методика
Приготовьте бактериальную суспензию исследуемой бактерии (0,1 ЕД) и
добавьте 2 мл ее в 50 мл стерильной тепловатой питательной агаровой среды.
Налейте эту среду в стерильные чашки Петри и дайте застыть. Приготовьте
суспензию известной концентрации испытуемого химического вещества в
дистиллированной стерильной воде. Зарядите стерилизованный диск
фильтровальной бумаги тестируемым химическим раствором и положите на
затвердевшую среду. Инкубируйте пластины при температуре 27 ±2 °C в
инкубаторе в течение 24 часов, чтобы зафиксировать зону ингибирования,
образованную вокруг диска из фильтровальной бумаги на бактериальном
газоне. Поддерживайте надлежащий контроль, то есть пластины с диском из
фильтровальной бумаги без загрузки тестируемым химическим раствором.
Образование зоны бактериального ингибирования вокруг бумажного
диска указывает на чувствительность тестируемого химического вещества к
бактерии. Измерьте зону ингибирования, образованную вокруг диска
фильтровальной бумаги на бактериальном газоне. Измерьте зоны, полученные
с различной концентрацией исследуемого химического раствора.
33.3. Определение минимальной ингибирующей концентрации (мик)
антибиотиков/пестицидов
Необходимый Материал
Испытайте химикат (антибиотики/бактерицид/пестицид), испытайте
бактериальную культуру, питательную агаровую среду, стерилизованные
пластины Петри, стерильную воду и так далее.
Методика
344
Приготовьте исходный раствор испытуемого химического вещества в
дистиллированной стерилизованной воде. Отмерьте необходимое количество
для добавления в питательную агаровую среду, чтобы получить требуемую
концентрацию испытуемого химического вещества, и добавьте в
стерилизованный тепловатый питательный агар. Таким образом, готовят
питательные агаровые пластины с различными концентрациями, а именно., 10,
25, 50, 100, 250, 500, 1000, и 2000 частей на миллион испытуемого химического
вещества и позволяют среде затвердевать. Приготовьте суспензию
тестируемой бактерии/культуры (0,1 ЕД), нанесите по 0,2 мл на каждую
тарелку и распределите стеклянной палочкой. Инкубируйте пластину при
температуре 27 ±2 °C в течение 48 часов, чтобы наблюдать рост/ингибирование
роста при данной концентрации.
Наблюдайте за пластинами для бактериального роста тестируемой
бактерии. Самая низкая концентрация, при которой ингибируется рост
бактерий, известна как минимальная ингибирующая концентрация этого
химического вещества для исследуемой бактерии.
33.4. Выделение устойчивых к антибиотикам/пестицидам мутантов
бактерий
Необходимый Материал
Испытайте пестицид (антибиотики/бактерицид/пестицид), питательный
агар, пластины Петри, пустую воду и так далее.
Методика
Приготовьте минимальную ингибирующую концентрацию и немного
более высокую концентрацию тестируемого пестицида в питательном агаре и
вылейте на тарелку. Затвердейте среду, удерживая пластину под углом 10°.
Приготовьте суспензию тестируемой бактерии (0,1 ЕД) и нанесите 0,2 мл на
затвердевшую среду и распределите стеклянной палочкой. Инкубируйте
пластины при температуре 27 ±2 °C в течение 5 дней для появления мутанта,
устойчивого к пестицидам.
345
Запишите развитие бактериальных колоний на MIC или следующей
более высокой концентрации, как мутант против указанного пестицида.
Возьмите бактериальные колонии и поддерживайте ту же концентрацию
пестицида на питательной агаровой среде.
33.5. Исследования перекрестной устойчивости бактерий к пестицидам
Необходимый Материал
Испытайте пестицид (антибиотик/бактерицид/пестицид), питательную
агаровую среду, стерильные пластины Петри, стерильную пустую воду и так
далее.
Методика
Приготовьте отдельные пластины питательной агаровой среды с
минимальной ингибирующей концентрацией тестируемых химических
веществ против тестируемых бактерий. На этих пластинах нанесите полосу
устойчивого к пестицидам мутанта известного пестицида и инкубируйте
пластины при температуре 27 ±2 °C в течение 4-5 дней. Наблюдайте за ростом
мутанта устойчивости к пестицидам на различных пластинах пестицидов,
чтобы определить перекрестную устойчивость.
Наблюдайте за ростом известного мутанта, устойчивого к пестицидам, на
пластинах другого пестицида. Если известный пестицидный мутант образует
рост на других пестицидных пластинах, предполагается, что мутант обладает
перекрестной устойчивостью к этому конкретному пестициду.
33.6. Исследования множественной лекарственной устойчивости бактерий
Необходимый Материал
Тестируемый препарат (антибиотики/бактерицид/пестицид), тестовые
бактериальные культуры, питательная агаровая среда, стерилизованные
пластины Петри, стерильные пипетки, стерильная вода и так далее.
Методика 1
Приготовьте питательные агаровые пластины с минимальными
ингибирующими концентрациями исследуемого препарата. Подготовьте
пластину № 1 с одним лекарством, пластину № 2 с двумя лекарствами,
346
пластину № 3 с тремя лекарствами и так далее. Приготовьте бактериальную
суспензию исследуемой бактерии (0,1 ЕД), добавьте 0,2 мл на каждую
пластинку и распределите стеклянной палочкой. Инкубируйте пластины при
температуре 27 ±2 °C в течение 3 дней и наблюдайте за развитием
бактериальных колоний в каждой пластине. Поддерживайте надлежащий
контроль над питательной агаровой пластинкой без каких-либо лекарств.
Запишите рост бактерий в соответствующей пластинке и определите
устойчивость, развившуюся к ряду лекарств.
Методика 2
Приготовьте питательный бульон, суспендируйте в пробирках в
соответствующем количестве и стерилизуйте. Добавьте минимальную
ингибирующую концентрацию соответствующего препарата в предписанную
пробирку. Приготовьте 1-ю пробирку с одним лекарством, 2-ю пробирку с
двумя лекарствами, 3-ю пробирку с 3 лекарствами и так далее. Приготовьте
бактериальную суспензию тестируемой бактерии (0,1 ЕД), добавьте 0,2 мл в
каждую пробирку и хорошо встряхните. Инкубируйте пробирки при
температуре 27 ±2 °C в течение 2 дней в инкубаторе. Возьмите полную петлю
суспензии из каждой пробирки и нанесите на пластины с питательным агаром,
а затем инкубируйте их при температуре 27 ±2 °C в течение 3 дней. Наблюдайте
за пластинами на предмет роста бактерий.
Запишите рост бактерии в соответствующей пластинке и определите
устойчивость, развившуюся к ряду лекарств.
33.7. Исследования патогенности бактерий с множественной
лекарственной устойчивостью
Необходимый Материал
Протестируйте бактериальную лекарственно-устойчивую культуру,
нативную патогенную культуру, растение-хозяин, шприц для подкожных
инъекций, дистиллированную воду и так далее.
Методика
347
Приготовьте суспензию тестируемой бактериальной культуры
лекарственной устойчивости (0,1 ЕД) и нативной патогенной культуры (0,1 ЕД)
отдельно. Инфильтрируйте эти суспензии (0,3 мл) в листья растения-хозяина
отдельно в локализованном месте и правильно их пометьте. Поддерживайте
привитое растение при температуре 27 ±2 °C с относительной влажностью
более 87 процентов для развития симптомов заболевания.
Понаблюдайте за привитыми листьями с обеих бактериальных культур и
сравните симптомы, развившиеся после 4-го дня и далее.
33.8. Лечение бактериального мутанта от устойчивости к антибиотикам
Устойчивость к определенному антибиотику представляет серьезную
угрозу при лечении бактериальной популяции тем же антибиотиком или
другими антибиотиками, если у бактерий развивается перекрестная
устойчивость к ним. Поэтому лечение бактерий от устойчивости к
антибиотикам очень важно для их лечения.
Хирамасти и др. (2012) описали процедуру лечения бактерий,
устойчивых к антибиотикам, и назвали такой антибиотик обратным
антибиотиком.
Необходимый Материал
Штамм бактерий, устойчивых к антибиотикам, Набомицин, питательная
агаровая среда, чувствительный к антибиотикам штамм той же бактерии и так
далее.
Методика
Возьмите устойчивый к хинолону штамм бактерий (золотистый
стафилококк или патогенное растение, если таковое имеется) с мутированным
геном gyr A. Возьмите чувствительный к хинолону штамм бактерий с
интактным геном gyr A. Выращивайте эти культуры на антибиотиках
набомицина. Культуры, выращенные на антибиотике Набомицин, должны
быть протестированы против хинолона на предмет их ингибирования роста.
Мутант, устойчивый к хинолону, выращенный на антибиотике
набомицина, возвращается к своей естественной культуре, которая затем
348
становится восприимчивой к антибиотику хинолона, тем самым излечивая ее
от устойчивости к антибиотикам.
33.9. Лечение устойчивости к антибиотикам, переносимым плазмидами
Необходимый Материал
Различные антибиотики, питательные агаровые пластины, бромистый
этидий, SDS, тестовая бактериальная культура и так далее.
Методика
Проверьте бактериальные изоляты на их устойчивость/чувствительность
к различным антибиотикам, таким как гентамицин, ампициллин, ванкомицин,
хлорамфеникол, тетрациклин, стрептомицин, пенициллин, эритромицин и
другие антибиотики. Выберите мутанта с устойчивостью к антибиотикам и
получите их культуры. Возьмите 24-часовые культуры мутантов, устойчивых
к антибиотикам, и выращивайте их в стерильном питательном бульоне,
содержащем бромистый этидий (100 мкг/мл) и 2 процента SDS. Инкубируйте
пробирки с бульоном при температуре 27 ±2 °C в течение 48 часов. Изолируйте
бактериальные колонии из этого бульона на питательном агаре, а затем
инокулируйте в простой питательный бульон и инкубируйте в течение 48
часов. Изолируйте бактериальные колонии, размножьте их наискось и
протестируйте против соответствующего антибиотика методом отравленной
пищи.
Мутант, устойчивый к антибиотикам, если он ингибирован или убит
одним и тем же антибиотиком, означает, что устойчивость к антибиотикам,
переносимым плазмидой, излечена.
349
34. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАЦИИ В БАКТЕРИАЛЬНОМ
ПАТОГЕНЕ РАСТЕНИЙ
Известно, что мутации в бактериальных патогенах растений происходят
по различным признакам, таким как мутация патогенности (потеря
вирулентности и бактериальные культуры становятся авирулентными),
мутация пигментации (потеря пигмента, особенно ксантомонадии у
ксантомонад, с образованием колоний альбиносов), мутация устойчивости к
антибиотикам (колонии мутантов устойчивы к антибиотикам и растут в их
присутствии), мутация морфологических признаков, физиологических
признаков или биохимических признаков и так далее.
Из-за условий окружающей среды или условий роста несколько клеток в
популяции бактерий мутируют в соответствии с определенным генетическим
признаком. Резкое изменение генетического характера известно как мутация и
происходит в одной из миллиона популяций. Это изменение в бактериях
является либо временным, либо постоянным. Временные вариации вызваны
факторами окружающей среды и не связаны с перестройкой ДНК. Такие
изменения могут быть морфологическими или физиологическими и исчезать,
как только изменения окружающей среды возвращаются в исходное
положение. С другой стороны, вариации у бактерий, которые включают
изменение ДНК, называются постоянными вариациями. Такие вариации могут
возникать в результате мутаций (изменение последовательности нуклеотидов
генома организма) и рекомбинации (добавление генов из внешнего источника,
таких как другие клетки). Мутации представляют собой постоянные
наследуемые изменения в генетической информации клетки и могут быть либо
монотонными (если они происходят случайным образом), либо
индуцированными (если они вызваны направленными химическими или
физическими агентами, называемыми мутагенами).
Микроорганизм, который демонстрирует естественное, немутированное
наследование, называется диким типом или диким штаммом, в то время как
350
мутантный штамм относится к измененной версии. Мутантные штаммы могут
демонстрировать различия в морфологии, характеристиках питания,
механизмах генетического контроля, устойчивости к химическим веществам,
температурных предпочтениях и практически любом типе ферментативной
функции. Применение мутантных штаммов заключается в отслеживании
генетических событий, раскрытии генетической организации и точном
определении генетических маркеров.
Генетические и биохимические исследования в бактериологии часто
начинаются с выделения мутантов. Чтобы обнаружить мутантов
определенного организма, необходимо знать нормальные или дикие
характеристики, чтобы распознать измененный фенотип. Поскольку мутанты,
как правило, встречаются редко, примерно по одному на 107 клеток, важно
иметь очень чувствительную систему обнаружения, чтобы редкие события не
были пропущены. Системы обнаружения у бактерий и других гаплоидных
организмов просты, потому что любой новый аллель должен быть замечен
немедленно, даже если это рецессивная мутация.
34.1. Выделение мутанта, устойчивого к антибиотикам, методом
градиентной пластины
Необходимый материал
Двадцатичетырехчасовая культура питательного бульона исследуемой
бактерии, две глубокие пробирки с питательным агаром (10 мл на
пробирку/культуру), раствор сульфата стрептомицина (1 процент, т. е. 10
мг/100 мл), стакан с 90-процентным этанолом, стерильные пластины Петри,
стерильная пипетка объемом 1 мл, разбрасыватель стеклянных стержней,
водяная баня, стеклянный маркировочный карандаш.
Методика
Подготовка градиентной пластины: Растопите две глубокие пробирки с
питательным агаром на водяной бане, поддерживаемой при температуре 96°C,
и охладите до 50 °C. Вылейте содержимое одной пробирки с агаром в
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]