Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
141
до фиолетового): указывает на использование молочных белков в качестве
источника углерода и азота этими видами.
Лакмусовая бумажка: указывает на окислительно-восстановительную
активность. Эта реакция начинается на дне трубки и распространяется вверх.
Пептонизация: происходит уменьшение размера творога и образуется
коричневатый супернатант, называемый сывороткой.
17.11. Снижение содержания нитратов
Состав среды: пептон-10 г; NaCl - 5 г; KNO3 (без нитритов)- 2 г; агар-3 г;
дистиллированная вода-1 л.
Методика
Дозируйте среду в пробирку на глубину 5 см и автоклав. Инокулят
пробирки со стерилизованной средой тест-бактерией и инкубируют при
температуре 27°C.
Восстановление нитратов может быть проверено до 15 дней с
регулярными интервалами в различных наклонных культурах путем
добавления нескольких капель сульфаниловой кислоты (0,8% в 5 Н уксусной
кислоте) и диметил-Альфа-нафтиламина (0,5% в 5 Н уксусной кислоте).
Нитрат уменьшается, если смесь становится розовой или красной.
Отсутствие цвета означает, что нитрат присутствует как таковой или не был
восстановлен до аммиака и свободного азота.
17.12. Оксидазный тест
Состав соевый агар Trypticase среднего: триптиказа-17 г; Фитон-3 г; NaCl
- 5 г; K2HPO4 - 2,5 г; глюкоза-2,5 г; агар–агар-15 г; дистиллированная вода-1 л;
рН-7,3.
Методика
Серия "овернайт" выросла культура тест бактерии на соевом агаре
trypticase пластины и инкубировать пластин при температуре 27°C в течение 24
часов. После инкубации добавляют 2-3 капли
142
тетраметилфенилендиаминдигидрохлорида на ростовую поверхность
исследуемого изолята.
Изменение цвета на темно-бордовый указывает на положительную
реакцию оксидазы.
17.13. Производство пигментов
Производство Флуоресцеиновых и Пикоцианиновых пигментов
Получение этих пигментов можно продемонстрировать с помощью
специальных агаров, в частности Tech (Pseudomonas P agar) и Flo (Pseudomonas
F agar). Производство флуоресцеина усиливается бактериальными культурами
на Фло-агаре из-за предельных уровней ионов железа в этой среде. Культуры,
продуцирующие флуоресцеин (Pseudomonas fluorescens) на Фло-агаре,
флуоресцируют, когда пластины открыты и просматриваются под
ультрафиолетовым излучением.
Пикоцианин-это сине-зеленый водорастворимый пигмент,
вырабатываемый P. aeruginosa. На технологическом агаре этот пигмент
появляется в течение 6-7 дней.
Инкубируйте тестовые бактериальные культуры на пластинах Flo и Tech
agar в течение 48 часов при температуре 28 + 2°C. Наблюдайте за пластинами
под ультрафиолетовым светом для получения флуоресцентного пигмента.
17.14. Испытания IMViC
Это состоит из четырех различных тестов: (1) производство индола, (2)
метил-красный, (3) Voges–Proskauer и (4) Использование цитрата. Название
IMViC расшифровывается как первая буква названия каждого теста в серии, с
нижним регистром “i”, включенным для удобства произношения. Тесты IMViC
были разработаны для дифференциации грамотрицательных кишечных
палочек (семейство Enterobacteriaceae), в частности Escherichia coli и группы
Enterobacter-Klebsiella, на основе их биохимических свойств и ферментативных
реакций в присутствии специфических субстратов.
17.14.1. Испытание на получение индола
143
Триптофан, незаменимая аминокислота, окисляется некоторыми
бактериями ферментом триптофаназой, в результате чего образуются индол,
пировиноградная кислота и аммиак. Индольный тест проводится путем
инокуляции бактерии в триптоновый бульон; индол, полученный в ходе
реакции, обнаруживается путем добавления реагента Ковача
(диметиламинобензальдегида), который образует вишнево-красный слой
реагента.
Необходимый материал
Питательные бульонные культуры исследуемых бактерий, пробирки,
содержащие 1 процент триптонового бульона (5 мл/пробирка), реагент Ковача,
флакон-капельница, пипетка по 1 мл, горелка Бунзена, инокуляционная игла.
Методика
Приготовьте (1%) триптоновый отвар: растворите 10 г триптона в 1 л
дистиллированной воды. Стерилизуйте в автоклаве при температуре 15 фунтов
на квадратный дюйм (121°C) в течение 15 минут. Инокулируйте бульон
триптона с тестируемой бактерией и держите одну пробирку в качестве
неинвазивного сравнительного контроля. Насиживают привиты и незасеянные
пробирки при температуре 28°C в течение 48 часов. После 48 часов инкубации
добавьте по 1 мл реагента Ковача в каждую пробирку, включая контрольную.
Осторожно встряхните пробирки через 10-15 минут. Разрешить трубы, чтобы
стоять, чтобы позволить реагент, чтобы прийти к вершине. Исследуйте
пробирки на предмет цвета в слое реагента.”
Развитие вишневого (глубокого) красного цвета в верхнем слое трубки
является положительным тестом на выработку индола. Отсутствие красной
окраски является отрицательным индолом.
Особенности
Используйте свежий отвар триптона для достижения наилучших
результатов. Повторное легкое встряхивание пробирок необходимо в течение
144
10-15 минут после добавления реагента Ковача для развития глубокого
красного цвета. Не инкубируйте инокулированные пробирки бульона тирптона
более 48 часов, потому что после 48 часов инкубации сам индол может
подвергнуться нападению и дальнейшему разложению. Если это произойдет,
индол в конечном итоге исчезнет, и вы можете получить вводящий в
заблуждение отрицательный результат теста.
17.14.2. Метил-красный и тесты фогеса–проскауэра
Метиловый красный (MR) и Voges–Proskauer (V-P) тесты используются
для дифференциации двух основных типов факультативных анаэробных
кишечных бактерий, которые производят большое количество кислоты и те,
которые производят нейтральный продукт ацетон в качестве конечного
продукта. Оба из них выполняются одновременно, потому что они
физиологически связаны и выполняются на одной и той же среде MR-VP
бульон. Противоположные результаты обычно получаются для тестов
метилового красного и Фогеса–Проскауэра, то есть MR+, VP− или MR−, VP+.
В этих тестах, если организм производит большое количество органических
кислот, то есть муравьиной, уксусной, молочной и янтарной в качестве
конечных продуктов, из глюкозы, среда останется Красной (положительный
тест) после добавления метилового красного индикатора рН (т. е. рН остается
ниже 4,4). В других организмах метиловый красный цвет становится желтым
(отрицательный тест) из-за повышения рН выше 6,0 из-за ферментативного
превращения органических кислот (образующихся при ферментации глюкозы)
в некислые конечные продукты, такие как этанол и ацетоин
(ацетилметилкарбинол).
Тесты MRVP представляют ценность при разделении Escherichia coli и
Enterobacter aerogenes (обе бактерии кишечной палочки), которые кажутся
практически идентичными, за исключением некоторых физиологических
различий, которые используются в качестве индикаторов санитарного качества
воды, пищевых продуктов, пищевых производств и предприятий
общественного питания.
145
Необходимый материал
Питательные бульонные культуры тест-бактерий, бульонные пробирки
MRVP (5 мл/пробирка), метиловый красный индикатор рН (флаконкапельница), V-P реагент I (раствор нафтола), V-P реагент II (40-процентный
гидроксид калия), чистые пустые пробирки, горелка Бунзена, инокуляционная
петля.
Методика
Приготовьте бульон МРВП (рН 6,9) из пробирок следующего состава:
пептон-7,0 г; декстроза/глюкоза-5,0 г; фосфат калия-5,0 г; дистиллированная
вода-1000,0 мл. Налейте по 5 мл бульона в каждую пробирку и стерилизуйте в
автоклаве при давлении 15 фунтов в течение 15 минут. Инокулируйте пробирки
МРВ с тестируемой бактерией как набор I и набор II и держите одну пробирку
в качестве неинвазивного сравнительного контроля. Инкубировать все
пробирки при температуре 28°C в течение 48 часов. Добавьте 5 капель
индикатора метилового красного в пробирку набора I. наблюдайте за
изменением цвета метилового Красного для МР-теста. Добавьте 12 капель V-P
реагента I и 2-3 капли V-P реагента II в пробирки набора II, а также в
неинвазивную контрольную пробирку. Осторожно встряхните пробирки в
течение 30 секунд с откинутыми крышками, чтобы подвергнуть среду
воздействию кислорода. Дайте реакции завершиться в течение 15-30 минут.
Наблюдать за пробками по изменению цвета теста ВП.
В МР-тесте метиловый красный индикатор в диапазоне рН 4 будет
оставаться красным (по всей пробирке), что свидетельствует о положительном
тесте, в то время как превращение метилового красного в желтый цвет является
отрицательным тестом.
В тесте VP развитие малинового до рубиново-розового (красного) цвета,
который может быть наиболее интенсивным на поверхности, свидетельствует
о положительном тесте VP, в то время как отсутствие изменения окраски
является отрицательным тестом.
17.14.3. Испытание на использование цитрата
146
Цитратный тест используется для дифференциации кишечных бактерий
на основе их способности использовать/ферментировать цитрат в качестве
единственного источника углерода. Утилизация цитрата зависит от наличия
фермента цитразы, вырабатываемого организмом, который расщепляет цитрат
до щавелевой и уксусной кислот.
Эти продукты позже ферментативно превращаются в пировиноградную
кислоту и углекислый газ.
Тест на цитрат проводится путем инокуляции микроорганизмов в
органическую синтетическую среду-Цитратный агар Симмонса, где цитрат
натрия является единственным источником углерода и энергии. В качестве
индикатора используется бромтимоловый синий. Когда лимонная кислота
метаболизируется, образующийся CO2 соединяется с натрием и водой, образуя
карбонат натрия щелочной продукт, который меняет цвет индикатора с
зеленого на синий, и это представляет собой положительный тест.
Бромтимоловый синий зеленый, когда кислый (рН 6,8 и ниже) и синий, когда
щелочной (рН 7,6 и выше).
Необходимый Материал
Питательные бульонные культуры тест-бактерий, уклоны Цитратного
агара Симмона, горелка Бунзена, инокулирующая игла.
Методика
Приготовьте Цитратный агар Симмонса (рН 6,9) следующего состава:
дигидрофосфат аммония 1,0 г; дикалийфосфат 1,0 г; хлорид натрия 5,0 г;
цитрат натрия 2,0 г; сульфат магния 0,2 г; агар 15,0 г; бромтимоловый синий
0,8 г; дистиллированная вода 10000,0 мл. Растворите все компоненты, кроме
фосфатов, которые должны быть растворены отдельно в 100 мл воды.
Смешайте их и доведите объем до 1 л. отрегулируйте рН до 6,9. налейте среду
в культуральные пробирки и стерилизуйте автоклавированием при давлении 15
фунтов в течение 15 минут и подготовьте скосы.
Инокулируйте уклоны Цитратного агара Симмонса с помощью тестбактерии с помощью колюще-полосатой инокуляции.
147
Другая трубка хранится в качестве неинвазивного сравнительного
контроля. Инкубируйте все скосы при температуре 28°C в течение 48 часов.
Наблюдайте за наклонными культурами для роста и окраски среды.
В привитом уклоне, когда рост виден на поверхности и цвет среды синий,
тест является цитратным положительным, а когда нет роста и нет изменения
цвета среды (то есть зеленого), тест является цитратным отрицательным
тестом.
Особенности
Всегда используйте легкие инокуляты, чтобы свести к минимуму перенос
питательных веществ из среды для выращивания инокулятов на уклонах
Цитратного агара Симмонса.
17.15. Каталазный тест
При аэробном дыхании в присутствии кислорода микроорганизмы
вырабатывают перекись водорода (Н2О2), которая является смертельной для
клетки. Фермент каталаза, присутствующий в некоторых микроорганизмах,
расщепляет перекись водорода до воды и кислорода и помогает им в их
выживании.
Каталазный тест проводят путем добавления Н2О2 к триптиказе соевого
агара наклонной культуры. Высвобождение пузырьков свободного кислорода
(O2↑) является положительным каталазным тестом.
Необходимый материал
Культуры тест-бактерий, триптиказа соевого агара наклонная, перекись
водорода (3%), горелка Бунзена, инокуляционная петля.
Методика
Готовят триптиказный соевый агар (рН 7,3) следующего состава:
триптиказа-15,0 г; Фитон-5,0 г; хлорид натрия-5,0 г; агар-15,0 г;
дистиллированная вода-1000,0 мл. Вылейте среду в культуральные пробирки и
колбы и стерилизуйте автоклавированием при давлении 15 фунтов в течение
15 минут. Инокулируйте триптиказу соевого агара наклонно тестируемой
бактериальной культурой. Держать незасеянной соевый агар trypticase уклоном
148
в контроль. Инкубируйте культуры при температуре 28°C в течение 24-48
часов. Держа инокулированную пробирку под углом, позвольте трем-четырем
каплям перекиси водорода течь по росту каждой наклонной культуры.
Наблюдайте за каждой культурой на предмет появления или отсутствия
пузырьков газа.
Положительная по каталазе культура будет производить пузырьки
кислорода в течение 1 минуты после добавления Н2О2.
149
18. ХАРАКТЕРИСТИКА ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
ВПЛОТЬ ДО РОДА
Клеточные, морфологические и биохимические признаки, используемые
для характеристики и определения рода растительных патогенных
бактериальных изолятов, приведенных Гарденом и Люсейтом,
проиллюстрированы в таблице.
Эти признаки/тесты включают реакцию грамм бактериальных клеток,
количество жгутиков и их положение, морфологию бактериальных колоний и
пигментацию колоний. Основные биохимические тесты включают
восстановление нитратов; производство ферментов; каталазы, оксидазы и
мочевины; углеводный обмен, то есть окислительный, неактивный или
ферментативный; и гиперчувствительную реакцию на табачные растения.
Некоторые бактериальные изоляты не производят HR на табаке, поэтому не
следует считать их неплантогенными патогенами.
После того как патогенность бактериальных изолятов проверена на их
естественном хозяине (откуда они были выделены) и обнаружены патогенные
или индуцированные симптомы заболевания, вышеуказанные признаки/тесты
должны быть проведены для определения бактериального рода
соответствующих изолятов.
Другие биохимические тесты, приведенные в предыдущих главах,
полезны для определения групп/видов/патогенов различных родов.
Аналогичным образом эти тесты также полезны для идентификации неплантпатогенных бактериальных изолятов, связанных с растительными
патогенными бактериями и существующих в ризосфере или филлоплане с
бактериальными растительными патогенами. Они могут оказывать
синергетическое или ингибирующее действие на бактериальные патогены
растений в/на растительной системе, и поэтому их идентификация также
необходима.
150
Таким образом, большинство морфологических, физиологических и
биохимических тестов, приведенных в предыдущих главах, необходимы для
идентификации того или иного бактериального изолята в лаборатории
бактериологии растений. Детальные характеристики растительных патогенных
бактерий каждого рода приведены в таблице 18.1.
18.1. Agrobacterium
Бактериальные клетки имеют палочковидную форму, размер 0,6–1,0 ×
1,5–3,0 мкм и встречаются поодиночке или парами. Они неспорообразующие и
грамотрицательные. Подвижность происходит от одного до шести пертрихоз
жгутиков. Они аэробны, обладают дыхательным типом метаболизма с
кислородом в качестве конечного акцептора электронов.
Некоторые штаммы способны к анаэробному дыханию в присутствии
нитратов. Большинство штаммов способны расти при пониженном
напряжении кислорода в тканях растений. Оптимальная температура-25-28°C.
Колонии обычно выпуклые, круглые, гладкие и непигментированные до
светло-бежевого цвета. Рост на углеводосодержащих средах обычно
сопровождается обильной внеклеточной полисахаридной слизью. Каталаза
положительная и обычно оксидаза и уреаза положительная. 3-Кетогликозиды
продуцируются большинством штаммов, принадлежащих к A. tumefaciens
biovar 1 и A. radiobacter biovar 1. хемоорганотрофы используют широкий
спектр углеводов, соли органических кислот и аминокислот в качестве
источников углерода, но не целлюлозу, крахмал, агар глюкозы, d-галактозу и
другие углеводы. Соли аммония и нитраты могут служить источниками азота
для штаммов некоторых видов и биоваров; другие требуют аминокислот и
дополнительных факторов роста. За исключением А. радиобактерии,
представители этого рода, проникают в крону, корни и стебли большого
разнообразия двудольных и некоторых голосеменных растений через почки,
вызывая трансформацию растительных клеток в автономно пролиферирующие
опухолевые клетки.иохимические тесты, приведенные в предыдущих главах,
необходимы при идентификации того или иного бактериального изолята в
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]