Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
31
Флороглюциновый тест на лигнин также хорошо подходит для раневых
десен и дает красный цвет, когда он присутствует главным образом в
клеточных стенках сосудистой ткани и склеренхимы. Раневые десны
скапливаются в межклеточных пространствах и просветах паренхимы, а также
в сосудах, прилегающих к бактериальной массе.
32
4. СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Стерилизация - это процесс, посредством которого происходит полное
уничтожение микроорганизмов и их спор на различных изделиях,
поверхностях и препаратах. Осуществляется термическим, химическим,
радиационным, фильтрационным методами.
Материал, необходимый в исследовательской лаборатории, в частности
стеклянная посуда и другие аксессуары нуждаются в стерилизации, их очистки
от живых микробов.
Общие методы стерилизации включают стерилизацию сухим теплом,
стерилизацию паром под давлением, фильтрацию и ультрафиолетовое
излучение.
4.1. Стерилизация стеклянной посуды
Стерилизация стеклянной посуды достигается сухой тепловой
стерилизацией. Стерилизация горячим воздухом производится в стерилизаторе
горячего воздуха. Температура стерилизатора поддерживается на уровне 160180°С в течение 60-90 минут. Если температура поднимется выше 180°C,
может произойти обугливание ватных пробок.
Методика
Стеклянная посуда должна быть хорошо вымыта и высушена, не должна
иметь никакого запаха. Чашки Петри с крышкой, колбы, пипетки, мензурки и
другие стеклянные изделия, подлежащие стерилизации, помещают в
стерилизатор, медленно увеличивают температуру до 170-180°C. Когда
температура достигнет 170-180°C, поддерживают температуру в течение 1
часа, а затем выключают прибор. Посуду достают только тогда, когда
температура достигнет уровня окружающей среды (при комнатной
температуре).
Особенности
33
Ни при каких условиях резиновые изделия, питательные среды не
должны стерилизоваться горячим воздухом. Они будут гореть и загораться в
инструменте. Колбы и пробирки не должны содержать жидкостей, необходимо
предварительно их высушить.
4.2. Стерилизация питательных сред
Для большинства типов питательных сред, резины и других материалов,
которые нельзя стерилизовать сухим жаром, используют стерилизацию паром
под давлением. Такой материал автоклавируют при температуре 121°С в
течение 30 минут в автоклаве.
4.2.1. Стерилизация автоклавом
Питательные среды, водяные заготовки, пустые пробирки с ватными
пробками и пипетки с ватными пробками стерилизуют в автоклавах под
давлением. Некоторые сахара разрушаются при стерилизации под давлением и
поэтому не должны стерилизоваться в автоклаве.
Методика
Питательные среды и любые другие материалы для стерилизации
помещают в автоклав, закрывают крышку и затягивают винты. После
достижения в автоклаве необходимого давление, его выдерживают в течение
30 минут. После этого выключают кнопку автоклав, чтобы довести давление в
до нормального. Когда давление достигнет нуля, извлекают стерилизованный
материал.
4.2.2. Стерилизация фильтрацией
Такие материалы, как некоторые сахара, разрушаются при нагревании,
поэтому для их стерилизации обычно используют фильтрацию.
Фильтры во время фильтрации удаляют бактерии через механическое
ситообразное действие мельчайших пор фильтра и через адсорбцию микробов
в фильтре из-за разницы их электрических зарядов.
Широко используемым является мембранный фильтр. Мембранный
фильтр представляет собой целлюлозную или пластиковую мембрану с
34
достаточно малым размером пор (обычно до 0,45 мкм) для улавливания и тем
самым удаления бактерий из жидкости. Другие фильтры, используемые в
стерилизации, включают спеченные стеклянные фильтры.
Методика
Фильтр, прикрепленный к колбе, предварительно стерилизуют в
автоклаве под давлением. Стерилизуемые растворы помещают в
фильтровальный стакан. Блок фильтрации подсоединяют к вакуумной
установке и начинают фильтрацию. По завершению фильтрации
отфильтрованный материал переносят в стерильные бутылки или пробирки по
мере необходимости.
4.3. Стерилизация почвы
4.3.1. Стерилизация паром без давления
Для микробов, которые не разрушаются сухим жаром или в автоклавах
при высоких температурах, используется прерывистая стерилизация, известная
как «тиндаллизация». Материал нагревают разово в течение 30 минут в потоке
пара (100 °C) в течение трех последовательных дней, позволяя ему остывать
при внутренней температуре между нагреваниями.
Этот метод обычно используется для стерилизации почвенного
материала. Эо позволяет справляться с теплостойкими спорами бактерий.
Методика
Стерилизуемую почву помещают в жестяную банку соответствующего
размера без крышки. Банку с почвой стерилизуют в течение 30 минут в
автоклаве при температуре 100 °C. Действие повторяют в течение трех дней
подряд.
4.3.2. Стерилизации с применением химических паров
Окись этилена и другие газообразные пары являются важными
стерилизующими агентами. Почвы овощных культур в питомниках с
приподнятыми грядками обычно стерилизуют данным методом.
Методика
35
Рыхлят почву приподнятой грядки и добавляют в нее этилен. Смешивают
почву с этиленом и накрывают пластиковым листом на 6 часов, чтобы пары
этилена высвободились и убили микробов в почве.
Далее покровный материал снимают и дают испарениям выйти из почвы.
Такие почвы используют для посева на грядках питомника.
4.3.3. Стерилизация с помощью солнечного тепла
Данные метод также используется для стерилизации почвы или грунтов
в теплицах под солнечным теплом.
Методика
Почву рыхлят и накрывают полиэтиленовыми листами черного цвета,
после чего подвергают воздействию солнечного света или высокой
температуры 40°C и более. Процесс термообработки продолжается не менее
пяти дней для достижения надлежащей стерилизации.
Легкое орошение почвы в процессе стерилизации повышает степень
стерилизации за счет образования горячего воздушного пара под
полиэтиленовым листом.
4.4. Стерилизация рабочего места
4.4.1. Ультрафиолетовым излучением
Рабочее место и окружающая среда или пространство в рабочей зоне
стерилизуются ультрафиолетовым излучением.
Методика
Рабочую зону очищают с использованием метилированного спирта.
Включают ультрафиолетовый свет и оставляют его на 30 минут. В ламинарных
шкафах используют соответствующий режим для создания потока воздуха,
проходящего через ультрафиолетовое излучение. После проведения
процедуры рабочую зону снова протирают метилированным спиртом
непосредственно перед началом работы под ламинарным потоком воздуха.
Не рекомендуется работать непосредственно под ультрафиолетовым
излучением. Ультрафиолетовое излучение выключают перед началом работы.
36
5. СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
РАСТЕНИЙ
Фитопатогенные бактерии, как и все другие живые организмы,
нуждаются в основных питательных веществах для поддержания жизни.
Пищевой материал, на котором бактерии выращиваются в лаборатории,
известен как питательная среда, а сам рост называется культурой. Другими
словами, питательный препарат, на котором или в котором выращивается
культура (то есть популяция бактерий) в лаборатории, называется питательной
средой. Хотя бактериальные патогены имеют одни и те же основные
требования, существует разнообразие в отношении использования
органических и неорганических соединений. Таким образом, питательные
среды различаются по форме и составу в зависимости от вида бактерий,
подлежащего культивированию. Некоторые среды содержат растворы
неорганических солей и могут быть дополнены органическими соединениями,
в то время как другие среды содержат сложные ингредиенты, такие как
экстракты или перевары растительных и животных тканей. Эти градиенты, за
исключением агара, используются для приготовления бульона или жидких
сред. Агар, который разжижается при нагревании до 96°С и затвердевает в
студень при температуре 40-45°С, используется для отверждения жидких сред.
Питательные среды имеют различную классификацию в зависимости от
химического состава, физического состояния и полезного назначения.
Исходя из их состава, можно выделить три основных типа питательных
сред:
1. Естественные или эмпирические культурные среды
2. Полусинтетические носители
3. Синтетические или химически определенные питательные среды
Точный химический состав природной среды неизвестен. Те среды,
химический состав которых частично известен, называются
37
полусинтетическими средами. Среда, содержащая агар, становится
полусинтетической средой.
Синтетическая или химически определенная питательная среда состоит
из специальных веществ известного состава. Синтетическая среда может быть
универсальной средой, используемой для широкого спектра микроорганизмов;
селективной средой, используемой для выбранного микроба;
дифференциальной средой, используемой для дифференциального выделения
микроба; или аналитической средой, используемой для анализа витаминов,
аминокислот и антибиотиков. Таким образом, существует множество сред,
каждая рецептура которой дает некоторое преимущество для выделения,
поддержания, характеристики или роста определенных групп
микроорганизмов.
5.1. Основные жидкие среды (бульоны) для культивирования бактерий
Бактерии, в отличие от грибов, часто культивируются в жидком бульоне.
Наиболее распространенными компонентами основных сред, используемых в
обычной бактериологической лаборатории, являются мясной экстракт
(являющийся источником органического углерода, азота, витаминов и
неорганических солей) и пептон (полупереваренный белок). Они могут быть
изменены различными способами путем дополнения с некоторыми
специфическими химическими веществами или материалами, чтобы
обеспечить среду, пригодную для культивирования или демонстрации реакции
для определенных типов или групп бактерий.
Питательный бульон и глюкозный бульон рассматриваются в качестве
основных жидких сред для культивирования бактерий.
Приготовление питательного бульона
Растворите заданное количество компонентов в 1 л дистиллированной
воды для приготовления питательного бульона и кипятите на газовой горелке
до полного растворения всех ингредиентов. Отрегулируйте рН и стерилизуйте
в автоклаве при температуре 121 °C в течение 30 минут.
38
5.2. Основная плотная питательная среда для культивирования бактерий
5.2.1. Приготовление питательных агаровых сред
500 мл воды кипятите в литровой ёмкости, добавляя необходимое
количество ингредиентов, расчитанного на 1 л питательной среды, до их
полного растворения. Отфильтруйте питательный экстракт через марлю. В
другой колбе нагрейте ещё 500 мл воды. Понемногу добавьте 15-20 г агара в
горячую воду (96°C), чтобы растворить его. Смешайте полученный агар с
питательным экстрактом. При необходимости доведите объем до 1000 мл
добавлением дистиллированной воды. Полученную среду разливают по 200 мл
в пять конических колб или по 8 мл в пробирки для приготовления скошенной
или глубинной питательной среды.
Заткните колбы и пробирки, содержащие среду. Стерилизуйте при
температуре 121°C в течение 15 минут в автоклаве. Дайте пробаркам остыть в
наклонном положении (для получения скосов питательных сред) и в прямом
положении (для глубинного посева). Дайте колбам остыть до тех пор, пока их
можно будет держать в руках.
Питательную среду в колбах быстро разлейте по чашкам Петри в
асептических условиях. Дайте среде застыь. Стерилизованную среду (в колбах
или пробирках) можно хранить при комнатной температуре (25°C) в
непыльной среде (в течение недели) или в холодильнике (для длительного
хранения).
Особенности
Не заполняйте среду более чем на две трети емкости колб/пробирок,
используемых при автоклавирование.
Не заливайте слишком горячую среду в чашки Петри, так как это
приведет к образованию большого количества конденсата на крышке и, таким
образом, может привести к загрязнению культуры. Быстро залейте среду,
чтобы избежать загрязнения из воздуха, и как можно скорее закройте крышку.
Заливку среды производят в шкафу, оснащенном УФ-лампами, или с
39
ламинарно-фильтрованным потоком воздуха. Заливка должна производиться
вблизи пламени спиртовки или в асептических условиях.
5.3. Селективные и дифференцирующие среды
Селективными средами называют те, которые позволяют расти
определенной группе или типу организмов, предотвращая, задерживая или
подавляя рост других, тем самым облегчая изоляцию бактерий.
Cелективное действие вызывается добавлением определенных
химических веществ в среду, например, красителей, подавляющих рост
грамположительных бактерий и т.д.
Дифференциальная среда - это та среда, которая заставляет
определенные колонии развиваться дифференцированно от других
присутствующих организмов, производя характерное изменение в росте
бактерий или среде, окружающей колонии. Эти среды используются для
дифференциации морфологически и биохимически родственных групп
микроорганизмов.
5.3.1. Специальные среды для некоторых фитопатогенных бактерий
Большинство фитопатогенных бактерий растут на стандартных
питательных средах. Однако некоторые виды требуют определенных
компонентов в среде и, следовательно, требуют “специальной среды” для
своего роста. Рост этих бактериальных патогенов на такой среде более обильен,
в то время как на стандартной питательной среде он скуден или незначителен.
5.3.1.1. Специальная среда для Xanthomonas (Dye, 1962)
Состав среды: картофель, 300 г; пептон, 2,0 г; сахароза, 20,0 г; KH2PO4,
0,2 г; Na2HPO4, 0,5 г; Ca(NO3)2, 0,5 г; KCl, 0,05 г; FeSO4, 0,05 г; агар, 20,0 г;
дистиллированная вода, 1 л.
5.3.1.2. Специальная среда для Pseudomonas fluorescens (King B Medium)
Состав среды: протеазный пептон, 20 г; K2HPO4, 1,5 г; MgSO4х7H2O, 1,5
г; глицерин, 10 мл; агар, 20 г; дистиллированная вода, 1 л.
40
5.3.1.2.1. Специальная среда для обнаружения флуоресцентного
пигмента Pseudomonas fluorescens
Состав среды: панкреатический гидролизат казеина, 10 г; пептический
перевар животной ткани, 12 г; K2HPO4, 1,5 г; MgSO4х7H2O, 1,5 г, агар 15 г;
дистиллированная вода, 1 л; рН после стерилизации, 7.2 ± 0.2.
5.3.1.2.2. Специальная среда для обнаружения пикоцианинового
пигмента Pseudomonas fluorescens
Состав среды: пептический перевар животной ткани, 20 г; KSO4, 10 г;
MgCl2, 1,4 г; агар, 15 г; дистиллированная вода, 1 л; рН после стерилизации, 7,2
± 0,2.
5.3.1.3. Специальная среда для выделения пектолитических бактерий
Модифицированная среда Миллера–Шрота (Pierce and McCain, 1992).
Состав среды: маннитол, 10 г; никотиновая кислота, 0,5 г; L-asparagin
(безводный), 3 г; K2HPO4, 2 г; MgSO4х7H2O, 0,2 г; таурохолат натрия, 2,5 г;
дистиллированная вода, 1 л.
Отдельно смешивают и добавляют к горячей среде: тергитол 7
(гептадецилсульфат натрия), 0,1 мл; 2% нитрилотриуксусная кислота в 1,46%
КОН (20 г + 14,5 г КОН на литр), 10 мл; 0.5% бромтимоловый синий, 9 мл; 0.5%
нейтрального красного, 2,5 мл; 1Н раствор NaOH, 5 мл; 1% нитрата таллия, 1,75
мл; 0,33% CoCl2, 50 мкл.
В заключении добавляют: 1Н раствор NaOH, 15,3 мл; MOPS3, 4 г; 10%
CaCl2х2H2O, 12 мл; агар, 4 г; полипектат натрия, 18 г.
Примечание: Пектатная среда затвердеет при температуре 70°C и не
образует приемлемого геля при переплавке. Залитая среда на чашках не должна
иметь на поверхности конденсатной воды. Дайте им высохнуть в течение
нескольких дней. NaOH должен быть добавлен до того, как в среду будет
внесен полипектат. Конечный рН должен быть от 7,5 до 7,7.
Пектолитические бактерии появляются в виде колоний от розового до
оранжевого цвета, расположенных в глубоких ямках. Непектолитическая
бактерии образуют розово-оранжевые колонии без ямок. Pseudomonas spp.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]