Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
41
либо не растут на этой среде, либо образуют зеленые колонии без ямок, либо с
очень неглубокими ямками.
5.3.1.3.1. Среда Миллера и Шрота для выделения Эрвиний
Среда является диагностической для Erwinia spp. Колонии бактерий
Erwinia имеют желтый или оранжевый цвет в течение 1-3 дней. Затем колонии
меняют цвет от черного до сине-зеленого .
Состав среды (на 1 л среды):
Часть I: дистиллированная вода, 800 мл; агар, 20 г.
Часть II: тергитол 7 (гептадецилсульфат натрия), 0,1 мл; 2%
нитрилотриуксусная кислота в 1,46% КОН, 10 мл; 0.5% бромтимоловый синий,
9 мл; 0.5% нейтрального красного, 2,5 мл; 5Н раствор NaOH, 1 мл; 1% таллий
азотнокислый, 1,7 мл; 14мМ CoCl2 (0.83 г/250 мл H2O), 50 мкл.
Часть III: маннит или сорбит, 10 г; никотиновая кислота, 0,5 г; Lаспарагин (безводный), 3 г; K2HPO4, 2 г; MgSO4х7H2O, 0,2 г; таурохолат натрия,
2,5 г.
Растворите ингредиенты части II и части III в 50 мл воды. Растворите агар
в 800 мл воды, добавьте часть II и часть III, растворенных в воде, и доведите
объем до 1 л. Автоклавируйте среду. рН должен быть около 7,3. Среда имеет
сине-зеленый цвет.
Это лучшая среда для выделения Erwinia spp. Многие виды Pseudomonas
могут расти на среде MS; однако они никогда не становятся желтооранжевыми, но всегда остаются сине-зелеными. Рост наблюдают ежедневно в
течение 3-4 дней.
5.3.1.3.2. Селективная среда для Erwinia amylovora
Для дифференциации бактерий Erwinia amylovora от других бактерий
Erwinia, используют селективные среды. Состав среды (для 500 мл среды):
дистиллированная вода, 380 мл; сахароза, 160 г; агар, 12 г; кристаллический
фиолетовый, 0,8 мл; циклогексимид, 0,1%.
Исследуйте поверхность каждой бактериальной колонии с
использованием 30 - кратной увеличительной линзы с помощью наклонно
42
ориентированного источника света. Колонии Erwina amylovora развиваются в
характерных кратерах через 48-72 часа, но наиболее отчетливо проявляются
через 60 часов.
Erwinia herbicola и другие сапрофитные изоляты растут на этой среде, но
не образуют кратеров.
5.3.1.3.3 полу-селективных средах для бактерий Erwinia саrоtоvоrа ССП.
Саrоtоvоrа (Bdliya и Langerfeld 2005, )
Это амодифицированная кристаллическая фиолетовая двухслойная среда
полипектата натрия с 2,3,6-трифенилтетразолий хлоридом и L-аспарагином в
базальной среде и бромтимоловым синим в верхней, оба содержат триптон.
Наблюдение
От красных до розовых колоний Erwinia carotovora ssp. каротовра
появляется на синем фоне с образованием полости.
Примечание: добавление 1,2 мкг/мл полимиксина в сульфата в верхний
слой ингибирует рост Erwinia carotovora ssp. атросептика при одновременном
добавлении 32 мкг/мл критромицина в верхний слой подавляет рост Erwinia
chrysanthemi. Добавление 35 мкг/мкл новобиоцина ингибирует рост Bacillus sp.
Нетаргетные бактерии, такие как Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
marginalis, Ralstonia solanacearum и Erwinia herbicola, образуют розовые,
красные, желтые или белые колонии без образования полостей.
5.3.1.4 специальная среда для агробактерий
5.3.1.4.1 для изоляции агробактерий tumefaciens, которые (а Radiobacter
группа) из состава почвы среднего
Часть I: Вода-1 л; маннит-10 г; нитрат натрия-4 г; хлорид магния-2 г;
пропионат кальция-1,2 г; фосфат магния-0,2 г; сульфат магния-0,1 г;
бикарбонат натрия-0,075 г; карбонат магния-0,075 г; агар-20 г.
Часть II: берберин, 275 мг; селинит натрия, 100 мг; пенициллин г, 60 мг;
стрептомицин сульфат, 30 мг; циклогексимид, 250 мг; тиротрицин, 1 мг;
бацитрацин, 100 мг.
Процедура
43
Растворите ингредиенты части I в горячей воде путем кипячения и
автоклава. Добавьте ингредиенты из части II.
Отрегулируйте рН до 7,1 с помощью 1,0 Н HCl.
5.3.1.4.2 для выделения Agrobacterium tumefaciens соответствуют виды
(т. е. биовар 1) и Rubi
Состав среды
Л-arabitol, 3,04 г; NH4NO3, 0,16 г; КН2РО4, 0.54 г; K2HPO4, 1,04 г; солей
MgSO4.7H2O-0,25 г; taurocholate натрия, 0,29 г; 0,1 процента кристаллический
фиолетовый, 2,0 мл; агар-15 гр.
Отрегулируйте объем до 1 л водой и стерилизуйте в автоклаве. Добавить
K2TeO3, 0.08 г; и 2 процента циклогексимида, 1 мл.
5.3.1.4.3 для изоляции агробактерий, продуцируемых в трансгенных
корнях (биовар 2) Средний 2е
Состав среды
Эритрит - 3,05 г; NH4NO3 - 0,16 г; KH2PO4 - 0,54 г; K2HPO4 - 1,04 г;
MgSO4.7H2O - 0,25 г; таурохолат натрия - 0,29 г; 1% дрожжевой экстракт - 1
мл; 0,1% малахитовый зеленый-5,0 мкл; агар-15 г. довести объем до 1 л и
стерилизовать автоклавированием. Добавьте K2TeO3, 0,32 г; и 2% - ный
циклогексимид, 1 мл.
5.3.1.5 дрожжевая глюкозо-Мелово-Агаровая среда для поддержания
бактериальных культур
Состав среды
Дрожжевой экстракт-10 г; глюкоза-10 г; CaCO3 - 20 г; агар–агар-20 г;
Вода-1 л.
5.4. Подготовка скошенного агара
Скосы питательных сред используются для субкультуры и поддержания
бактериальных культур. Всегда легко и безопасно поддерживать
бактериальные культуры на скошенных средах.
Процедура
44
Налейте среду в пробирку на одну треть длины или объема пробирки и
заткните ее ватной пробкой. Поместите пробирки со средой в
стерилизационную корзину в вертикальном положении и стерилизуйте в
автоклаве под давлением 15 фунтов в течение 30 минут. Извлеките пробирки
после стерилизации и держите их в наклонном положении с помощью
деревянного бруска или ножной шкалы, чтобы получить наклоны. Когда
носитель затвердеет в наклонных положениях, соберите наклонные части и
храните в морозильной камере или используйте в соответствии с
требованиями.
45
6. ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ
РАСТЕНИЙ
Выделение бактерий из зараженного болезнью растительного материала
является важным этапом в определении причины заболевания растений и
подтверждения ее бактериального происхождения. Это также важно для
получения чистой культуры бактериального фитопатогена для его дальнейшей
идентификации вплоть до родового и видового уровня.
6.1. Выделение из образца больного растения
Для успешной изоляции бактериальных фитопатогенов важен подбор
материала для исследования. Из быстро развивающихся очагов поражения
бактерии могут быть легко выделены. На поздних стадиях развития поражения
выделение истинно патогенных бактерий становится затруднительным из-за
подавляющей популяции сапрофитов. Если пораженный образец не содержит
молодых очагов поражения, то желательно привить мацерат пораженной ткани
на здоровое растение-хозяин и полученные молодые очаги использовать для
выделения.
Прежде чем приступить к выделению, часть ткани из очага поражения
должна быть подвергнута тесту подтверждение наличия патогенов (глава 2),
чтобы убедиться в присутствии бактерий.
Необходимый материал
Больной образец растения, плотные питательные среды,
дистиллированная вода, раствор хлорида ртути, предметное стекло, скальпель,
прививочные иглы, спиртовка.
Методика
После подтверждения наличия фитопатогенных бактерий в растительной
ткани, возможно ее дальнейшее использования для выделения изолятов
бактерий. Для этого готовят суспензию из растительной ткани с несколькими
каплями воды и используют для выделения любым из следующих способов.
46
1. Дробный посев
Чашку Петри расчерчивают со стороны дна или визуально на несколько
секторов. Бактериологической петлей с исследуемой суспензией делают
«штрихи» по поверхности агара в каждом из секторе, перенося часть материала
из предыдущего сектора в следующий. Между секторами необходимо
прожигать петлю в пламени спиртовки. Посевы инкубируют в перевернутом
положении при температуре 25-28 °C в течение нескольких дней с ежедневной
фиксацией результата. Большинство бактериальных фитопатогенов развивают
колонии в течение 3-5 дней, но некоторым из них требуется до 10 дней.
Одиночные колонии обычно получают на втором или третьем секторе.
2. Посев суспензии из пораженной ткани
В тех растительных образцах, где наличия слизи при постановке
подтверждающих тестов на наличие фитопатогена в растиетльном образце не
видно, выделение бактерий производится методом мацерации растительных
тканей. Образец для исследования стерилизуют болезни в 0,1% растворе
хлористой ртути в течение 1-2 минут, трижды промывают в дистиллированной
воде и размачивают пестиком в ступке с достаточным количеством
стерилизованной воды. Дают суспензии отстаятся и отбирают пипеткой 0,2 мл
супернатанта на питательную среду в чашке Петри. Надосадочную жидкость
наносят в отдельные секторы на питательной среде и распределяют по
поверхности бактериологической петлей. Посевы инкубируют и наблюдают за
развитием колоний.
3. Метод предельных разведений
Бактериальную суспензию, приготовленную из инфицированной ткани,
разбавляют последовательно в 5 мл стерильной воды. Обычно достаточно трех
разведений. По одной капле исходной суспензии и трёх её последовательных
разведений помещают в четыре отдельные чашки Петри с розлитой
питательной средой. Капли равномерно распределяют по поверхности агара с
помощью стерильного шпателя. Посевы инкубируют и наблюдают за
развитием одиночных колоний.
47
4. Метод глубинного посева
Плотную питательную среду (1,5% агара) стерилизуют по 9 мл в
пробирках и дают остыть до 45°С. Инокулируют одну пробирку 1 мл суспензии
из мацерата пораженной ткани. Тщательно перемешивают, вращая пробирку
между ладонями. Далее стерильной пипеткой перенося 1 мл полученного
разведения во вторую пробирку и тщательно перемешивают. Повторяют
процедуру несколько раз, оптимальным является 3-кратное разведение.
Полученные разведения выливают по отдельным стерильным чашкам Петри,
дают застыть и инкубируют в перевернутом положении.
6.2. Выделение из образца почвы
Многие фитопатогенные бактерии также могут быть изолированы из
почвы, поскольку зараженные листья и растительный мусор падают на землю,
а разлагающийся зараженный материал высвобождает бактерии. Такие почвы
можно использовать для выделения фитопатогенных бактерий, когда на
молодых растениях отсутствуют симптомы заражения.
Необходимый материал
Образец почвы из-под больного растения, плотная питательная среда,
дистиллированная вода, стерильные пипетки, инокулирующая игла,
стерильный стеклянный шпатель.
Методика
Образец почвы отбирают на глубине 2-7 см под растением в случае
пятнистости листьев и из ризосферы в случае увядания растения. 10 г образца
почвы разбавляют в 100 мл дистиллированной воды и дают отстояться.
Отбирают 1 мл суспензии и делают последовательные разведение до 10-8.
На заранее подготовленные чашки Петри с питательной средой наносят
по 0,1 мл полученных разведений и распределяют по всей поверхности агара с
использованием стерильных шпателей. Для достоверности получаемых
результатов проводят до трех повторений. Посевы инкубируют при
температуре 28±2°C и наблюдают для развития бактериальных колоний.
48
Большинство фитопатогенных бактериальных колоний появляются на среде
через 3 дня. В дальнейшем у полученных и отобранных колоний должна быть
определена их патогенность по отношению к растению-хозяину.
6.3. Выделение из образца полевой воды
Фитопатогены могут быть выделены из полевых вод из оросительных
каналов. Это эффективно в тех случаях, когда бактериальное распространение
происходит через оросительную систему, например, бактериальная гниль риса.
Необходимый материал
Полевая проба воды, фильтровальная бумага, плотные питательные
среды, стерильные пипетки, инокулирующая игла, шпатели и др.
Методика
Пробу воды отбирают с поля или из оросительной системы в
подготовленную банку или бутылку. Далее отобранную пробу необходимо
отфильтровать для удаления грязи, грибковых и водорослевых структур, если
таковые имеются. Фильтрат используют для высева на питательные среды.
Приготовьте питательную среду и разлейте по чашкам Петри.
Допускается добавление в среду какого-либо фунгицида. На застывшую среду
нанесите 0,1 мл суспензии фильтрата воды и распределите по всей площади
питательной среды. Сделайте пять посевов данного фильтрата воды.
Инкубируют посевы при температуре 28 ± 2°C.
Большинство фитопатогенных бактериальных колоний появляются в
среде через 3 дня. Не отбирайте колонии, которые появляются в течение 24 или
48 часов. Полученные и отобранные колонии должны быть оценены на предмет
их патогенной природы.
6.4. Выделение из зараженного семенного материала
Зачастую бактерии, вызывающие болезни растений, передаются с
семенами и могут быть выделены из семенного материала.
49
6.4.1. Выделение бактерий, переносимых на внешней поверхности семян
Необходимый материал
Исследуемый семенной материал, питательные среды, стерильные
щипцы, промокательная бумага и др.
Методика
Исследуемые образцы семян помещают на стерильную промокательную
бумагу, пропитанную водой, на 4-8 часов. Затем семена переносят на
питательные среды в чашках Петри и инкубируют при температуре 28 ± 2°C.
Бактериальный рост, появляющийся на семенах и вокруг них, отбирают,
культивируют для выделения чистых культур и оценивают их патогенность.
6.4.2. Выделение внутрисеменных бактерий
Необходимый материал
Исследуемый семенной материал, питательные среды, раствор хлорида
ртути, стерильные пестик и ступку, пробирки со стерильной водой, стерильные
пипетки и др.
Методика
Исследуемый семенной материал отбирают и стерилизуют в 0,1процентном растворе HgCl2 в течение 60 секунд с тремя последующими
промывками дистиллированной водой. Одну половину семян помещают на
подготовленную питательную среду в чашках Петри.
Другую половину семян размачивают в ступке с 2 мл дистиллированной
воды. Полученный мацерат переносят на питательную среду в чашках Петри.
Посевы инкубируют при температуре 28±2°C. За результатом наблюдают в
течение 72 часов и отбирают выросшие бактериальные колонии.
Бактериальные колонии, которые появляются при посеве из мацерата,
указывают на внутреннюю бактериальную инфекцию семенного материала.
Если колонии появляются и с первой, и со второй половин семян, это
свидетельствует о внешней и внутренней семенной инфекции.
50
7. ОЧИСТКА ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
КУЛЬТУР
При выделении бактериального возбудителя из пораженных образцов
растений на питательных средах также растет некоторое количество
непатогенных и сапрофитных бактерий. Как правило, такие колонии
появляются гораздо раньше, чем колонии фитопатогенных бактерий. Зачастую
сапрофитные бактериальные колонии смешиваются с фитопатогенными
бактериальными колониями. В этой связи отбор патогенных бактерий и их
очистка является важным шагом для получения чистой культуры
бактериального возбудителя болезней растений.
Помимо этого, в процессе хранения бактериальных культур возможно их
контаминация другими микробами, в связи с чем вознкает необходимость в
поддержании таких культур.
Необходимый материал
Чашки с изолированными бактериями, питательные агаровые среды,
прививочная игла, маркер, инкубатор и др.
7.1. Получение одиночных бактериальных колоний
При правильном отборе пораженной ткани растений зачастую
происходит развитие только колоний возбудителя.
Однако во многих случаях колонии сапрофитных бактерий развиваются
вместе с фитопатогенными бактериями. Если по итогам культивирования
наблюдается более одного типа колоний, то предпочтительнее выбрать
репрезентативные колонии бактерий. Кроме того, колонии, которые появились
позднее в большинстве случаев являются колониями фитопатогенных
бактерий. Особое внимание стоит обращать на колонии бактерий, которые
появляются позднее 48 часов культивирования. При работе с ранее не
описанными патогенами желательно выделить два или три типа колоний. Их
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]