Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
21
2. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ НАЛИЧИЯ ПАТОГЕНОВ
БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ПОРАЖЕННЫХ
ОБРАЗЦАХ РАСТЕНИЙ
Прежде чем приступить к выделению бактерии из образцов больного
растения, желательно подтвердить наличие бактерии в пораженных тканях.
Для этого применяют следующие тесты.
2.1. Тест на слизь
Данный тест подходит для выявления локализованной бактериальной
инфекции листьев, стебля, почек, цветка и плода.
Необходимый материал
Образец больного растения, предметное стекло, покровное стекло,
дистиллированная вода, микроскоп, скальпель, фильтровальная бумага.
Методика
Промывают пораженную часть растения в проточной водопроводной
воде для удаления грязи. Образец высушивают прикосновением
фильтровальной бумаги. Кусочек зараженной части ткани растения отрезают
стерильным скальпелем и помещают на предметное стекло. Наносят несколько
капель воды на срезанную часть и накрывают покровным стеклом.
Предметное стекло выдерживают при комнатной температуре в течение
5 минут для выхода бактериальной слизи и исследуют под объективом низкой
мощности.
Результат
Если инфекция вызвана бактериями, мутная масса бактериальных клеток
будет видна просачивающейся через срезанные концы кусочков растительной
ткани.
Особенности
Данный метод позволяет также получить некоторое представление о том,
является ли инфекция паренхиматозной или сосудистой. При сосудистых
22
инфекциях бактерии с силой просачиваются в различные точки,
соответствующие сосудистым нитям; при паренхиматозных инфекциях
просачивание бактерий происходит медленно, диффузно и по всему разрезу.
Этот тест хорошо работает при большинстве бактериальных
заболеваний. Трудности могут возникнуть при заболеваниях, когда
пораженная ткань может не содержать бактериальных клеток. В тканях,
содержащих большое количество крахмала, рассеивание частиц крахмала в
воде может маскировать бактериальную слизь и затруднять ее распознавание.
Однако с некоторым опытом можно отличить бактериальную слизь от
крахмала.
2.2. Тест на молочную воду
Этот тест более подходит для выявления системных и сосудистых
инфекций в листьях, стебле и корнях. Обычно проводится для обнаружения
бактериальной болезни риса.
Необходимый материал
Образец пораженного растения, дистиллированная вода, пробирка,
скальпель, фильтровальная бумага.
Методика
Образец пораженного растения промывают в проточной водопроводной
воде для удаления грязи, высушивают при помощи фильтровальной бумаги.
Далее отрезают кусочек зараженного листа, стебля или образца корня.
Отрезанную часть зараженного образца погружают в пробирку с 10 мл
дистиллированной воды и дают ей постоять от 3 до 5 минут.
Результат
При наличии возбудителя наблюдается тянущийся след бактерий,
энергично выходящий из зараженной части разреза, который придает чистой
воде беловатый мутный или молочный вид.
23
2.3. Тест на выделение бактериальной массы из растения
Тест на выделение бактериальной массы из растения используется для
подтверждения наличия бактериального патогена в образце растения с
признаками сосудистого заболевания. Тест чаще всего используется для
обнаружения возбудителей рода Pseudomonas, Ralstonia в корнях баклажанов,
томатов, табака, картофеля и др.
Необходимый материал
Образец увядшего растения вместе с корнем, дистиллированная вода,
мензурка, скальпель, фильтровальная бумага.
Методика
От больного растения отделяют корень. Корень промывают в
водопроводной воде для удаления частиц почвы, высушивают его на
промокашке. В мензурку или пробирку набирают дистиллированную воду.
Далее часть корня отрезат под углом 45° и подвешивают срезанный конец в
воде с помощью нити и оставляют на 10-15 минут.
Результат
В воде невооруженным глазом будет видна струйка бактериальной слизи.
Сочение слизи из корня растения подтверждает участие бактерий в качестве
возбудителя заболевания.
2.4. Путем окрашивания измельченной части больного растения
В тех случаях, когда бактериальная популяция в пораженной ткани очень
низка, как в случае поражений молодых растений, отчетливого слизистого
следа может не быть.
В таких случаях окрашивание мазков из пораженной ткани позволит
выявить наличие бактериальных клеток.
Необходимый материал
Пораженный образец листьев, предметное стекло, дистиллированная
вода, скальпель, краситель (кристаллический фиолетовый, карболовый фуксин
и т.д.), спиртовка, микроскоп, иммерсионное масло.
24
Методика
Образец пораженной ткани промывают в проточной водопроводной воде
для удаления грязи. Далее его высушивают. Кусочек больной ткани
раздавливают в капле воды на одном из концов предметного стекла. Дают ему
постоять в течение 1 минуты, а затем наклоняют предметное стекло так, чтобы
водная суспензия текла к другому концу предметного стекла. Приготовленный
таким образом мазок высушивают и фиксируют, проводя над пламенем
спиртовки. Мазок окрашивают одним из крастелей, дают подсохнуть и
осматривают под объективом на наличие бактериальных клеток.
Результат
Если присутствие бактерий не обнаруживаются одним из тестов на
наличие бактериальной слизи или окрашиванием, то нет смысла пытаться
изолировать их из такого материала.
25
3. ГИСТОПАТОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Наличие бактериальных патогенов в тканях растений-хозяев и
вызываемые ими изменения в этих тканях растений изучаются с помощью
гистопатологии инфицированного растительного материала. Локализация
бактериального патогена в межклеточном или внутриклеточном пространстве
или в сосудистых тканях может быть выявлена с помощью разрезания
микротомов и окрашивания растительного клеточного материала.
3.1. Определение локализации бактериальных патогенов в растение-
хозяине
Для определения точной локализации бактерий в пораженной ткани
желательно, чтобы материал фиксировался в подходящем убивающем и
фиксирующем растворе. В срезах свежего материала значительная доля
бактериальной популяции может быть потеряна, если срезы переносятся в
воду.
Наиболее желательными убивающими и фиксирующими растворами
являются формалин–уксусная кислота–спирт (FAA) и FAA, насыщенные
хлористой ртутью. Преимущество последнего заключается в том, что он
помогает связать бактериальные клетки вместе и таким образом сохраняет
бактериальную массу неповрежденной без выщелачивания или рассеивания во
время разрезания и окрашивания.
Фиксирующий раствор (FAA)
Спирт (50%)
Формалин
Уксусная кислот
100 мл
6,5 мл
2,5 мл
Необходимый материал
Образец пораженного растения, микротом, скальпель, фиксирующий
раствор, дистиллированная вода, предметное стекло, покровное стекло,
26
фильтровальная бумага, дифференциальные пятна, спирт, ксилол, бальзам,
микроскоп и так далее.
Методика
Образец пораженного растения промывают в проточной водопроводной
воде для удаления грязи. Высушивают и разрезают материал на кусочки
размером 5 мм с помощью микротома, переносят в FAA. Минимальное время,
необходимое для фиксации, составляет 48 часов, но материал может храниться
в течение любого периода времени. В FAA, насыщенном хлоридом ртути,
кусочки ткани выдерживают в течение 48 часов, промывают в FAA для
удаления избытка хлорида ртути и консервируют в FAA.
Срезанные участки окрашивают кислотным фуксином (смонтировать
срезы в 0,1-процентном кислотном фуксине в лактофеноле), дают постоять 510 минут и исследуют.
Либо окрашивание проводят дифференциальным красителем,
окрашивают срез карболтионином в течение 5 минут (тиониновый синий - 0,1
г, кристаллы фенола - 5,0 г, вода - 100 мл). Промывают в воде и переносят на
95-процентный спирт в течение минуты. Далее помещают в Orange G на
несколько минут. Промывают в чистом спирте. Очищают в ксилоле и
монтируют.
Результат
При окраске кислотным фуксином бактерии окрашены в темно-красный
цвет, а стенки клеток-хозяев-в розовый. В пораженных тканях колеоптилей,
листовых пластин, стеблях и т. д., которые содержат мало или вообще не
содержат хлорофилла, бактериальные клетки могут быть эффективно
обнаружены данным методом.
При оксраске дифференциальным красителем бактерии окрашиваются в
темно-синий цвет, клеточные стенки в желтый или зеленый, а разжиженная под
воздействием бактерий ткань в светло-голубой.
Подготовка срезов микротома и окрашивание для биологических
исследований
27
Необходимый Материал
Образец заболевания, фиксирующий реагент, обезвоживающий реагент,
Промокашка, микроскоп и так далее.
Процедура
Промойте образец болезни в проточной водопроводной воде, чтобы
удалить грязь, и высушите промокательной бумагой/папиросной бумагой.
1. Уничтожение и фиксация растительного материала: процедура
проводится в FAA или FAA-хлориде ртути, как описано в предыдущем разделе.
2. Обезвоживание: растительный материал, пораженный бактериями,
лучше всего обезвоживается в серии третичных бутиловых спиртов (Jensen,
1962).
3. Инфильтрация и заделка: наполните флакон на три четверти
расплавленным парафином и дайте ему затвердеть, но не полностью остыть, а
затем перенесите материал из жидкой парафиновой смеси третичного
бутилового спирта на затвердевший парафин во флаконе. Покройте материал
свежей жидкой парафиновой смесью третичного бутилового спирта и
поместите флакон в парафин по крайней мере на 1 час или до тех пор, пока
материал не опустится на дно флакона. Вылейте всю смесь, оставив во флаконе
только растительный материал, и замените его чистым расплавленным
парафином (m.p. 52°C). Дайте еще две смены парафина с интервалом в 2 часа
и дайте материалу остаться на ночь погруженным в воск.
4. Размягчение парафиновой ткани: некоторые части растительного
материала, такие как стебель, семя и т. д., становятся хрупкими во время
обезвоживания, и становится трудно получить неповрежденные участки. Такой
материал можно размягчить в 1-процентном водном растворе лаурилсульфата
натрия (90 мл) в глицерине (10 мл; Alcorn and Ark, 1953). Обрежьте
парафиновый блок так, чтобы обнажилась поверхность закладываемого
материала, подлежащего секционированию. Переверните блок во флаконе,
содержащем ровно столько размягчающего раствора, чтобы покрыть открытую
28
поверхность. Время, необходимое для размягчения, составляет от 24 до 28
часов, в зависимости от материала.
5. Секционирование: срез закладываемого материала толщиной 10-12
мкм с помощью вращающегося ручного микротома.
Парафиновые ленты, содержащие срезы, фиксируются на предметных
стеклах клеем Хаупта (Johansen, 1940).
Состав клея Хаупта: растворить 1 г мелкодисперсного желатина в 100 мл
дистиллированной воды при температуре 30°С и добавить 2 г кристаллов
фенола и 15 мл глицерина. Смешать и отфильтровать. Нанесите очень тонкую,
но однородную пленку клея на предметное стекло и немедленно залейте его 4процентным водным раствором формалина. Разрежьте ленту на полосы,
содержащие нужное количество секций, и плавайте над раствором формалина.
Осторожно нагрейте предметное стекло, чтобы лента стала прямой и плоской.
Охладите предметное стекло и слейте раствор формалина, удерживая ленту в
нужном положении с помощью щетки из верблюжьей шерсти, и держите ее при
температуре 30,0°C для тщательной сушки.
6. Окрашивание: график окрашивания гематоксилином Харриса и
оранжевым G отлично подходит для локализации бактериальных клеток в
пораженной ткани. Высушенные слайды пропускают через следующие серии
(Johansen,1940; Dickey, 1967).
Наблюдение
Бактериальные клетки окрашиваются в темно-синий цвет, а стенки
клеток-хозяев серовато-оранжевые.
3.3. Изучение изменений химических составляющих пораженных тканей
растений
Для изучения изменений химических составляющих пораженных тканей
растений предпочтительны срезы из свежих нефиксированных материалов.
Каждая секция должна содержать примерно половину инфицированных и
половину здоровых тканей.
29
3.3.1. Разложение целлюлозы
Следующие два метода используются для определения деградации
целлюлозы патогеном (Rawlins and Takahashi, 1952).
Необходимый Материал
Срез ткани, реагент, микроскоп и так далее.
1. Метод двойного преломления: смонтировать срез в воде и исследовать
в поляризационном микроскопе.
Вращайте сцену до тех пор, пока клеточные стенки в здоровой ткани не
станут ярче. Теперь осмотрите зараженную ткань. Если целлюлоза разлагается,
стенки клеток-хозяев вокруг бактериальной массы не будут казаться яркими.
2. Реакция целлюлозы с цинк-хлор-йодом: смонтировать срез в несколько
капель цинкхлориодина и наблюдать под микроскопом. Через несколько минут
целлюлозосодержащие стенки в паренхиме и меристематической ткани
становятся синими. В случае, если бактерия разлагает целлюлозу, клеточные
стенки вокруг бактериальной массы не имеют синего цвета. (Чтобы
приготовить цинк-хлор-йод, растворите 50 г хлорида цинка и 16 г KI в 17 мл
воды. Добавьте избыток йода и дайте постоять несколько дней. Надосадочная
жидкость хранится в коричневой бутылке.)
3.3.2. Разложение пектиновых веществ
Необходимый Материал
Секция микротома, ФФА, спирт, хлорид железа, калийферроцианид,
дистиллированная вода, воск, ксилол, микроскоп и так далее.
Процедура
Для окрашивания пектиновых веществ можно использовать
микротомные срезы из фиксированного FAA материала. Растворите воск в
ксилоле и доведите предметное стекло до воды через 95, 70 и 50 - процентный
спирт. Поместите предметное стекло в 10-процентный раствор Fecl2 на 10-20
минут, а затем промойте в 4-5 сменах дистиллированной воды в течение 15
минут. Добавьте 1-2 капли 2-процентного раствора ферроцианида калия на
срезы.
30
Примерно через 2 минуты добавьте каплю 2-процентного горячего
раствора ферроцианида и наблюдайте под микроскопом.
Наблюдение
Клеточные стенки с неповрежденным пектиновым материалом дадут
персидский синий цвет, в то время как те, где пектин был разрушен бактерией,
остаются незапятнанными или окрашиваются только слегка.
3.3.3. Деградация белка
Необходимый Материал
Срезы тканей, дистиллированная вода, нингидрин, микроскоп и так
далее.
Процедура
Используйте секции из спиртового фиксированного или свежего
материала. Промыть срезы в воде и смонтировать в 0,25-процентном растворе
нингидрина. Направляйте предметное стекло в течение 1-5 минут, пока не
появится синий цвет здоровой ткани. Исследуйте образец зараженной ткани в
микроскоп.
Наблюдение
Если белок деградирует, интенсивность синего цвета будет больше в
инфицированных тканях, чем в здоровых.
3.3.4. Деградация лигнина
Необходимый Материал
Раздел микротома, флороглюцинол, микроскоп и так далее.
Процедура
Смонтируйте срезы в несколько капель насыщенного хлороглюцина в 18
- процентном HCR и наблюдайте под микроскопом.
Наблюдение
Одревесневшие клеточные стенки становятся красными в течение
нескольких минут. Если лигнин разлагается патогеном, клеточная стенка будет
казаться бесцветной.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]