Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
181
22.5. Определение фактора секреции гликопротеинов
Внеклеточный гликопротеин (ГП), секретируемый патогенными
бактериями растений, способен индуцировать симптомы ВС при болезнях
пятнистости листьев, и количество ГП играет важную роль в индукции
симптомов ВС. Количественная, а также качественная секреция ГП при
размножении бактериальных патогенов растений, по-видимому, имеет важное
значение для индуцирования реакции WS.
Фактор секреции ГП, определенный Боркаром (1989а), представляет
собой количество ГП (мл), продуцируемое 1 × 107 исходной
колониеобразующей единицей (кое) бактериального клона в течение периода
их роста в час инкубации и обозначается в мл.
Методика
Для получения ГП-пластины 1 × 107 кое Ксантомонад на среде LPGA
(экстракт печени-7 г; пептон - 7 г; агар-20 г; Вода-1 рН 7,0) и инкубируют при
26°С в течение различного периода, например 1-7 дней. Урожай
культивируемого бактериального роста суспендируют в 500 мл
дистиллированной воды и хорошо встряхивают. Бактериальную суспензию
центрифугируют при 19000 об / мин в течение ночи в ультрацентрифуге при
температуре 4°С, а супернатант фильтруют через Миллипорный (0,44 мкм)
фильтр. Фильтрат осаждают сульфатом аммония. Осажденный GP собирают,
измеряют и диализируют в течение 2-3 дней при температуре 4°C.
Определите фактор секреции GP, используя приведенную выше
формулу.
Необходимо оценить содержание сахара и белка в ГП, секретируемых в
разные временные интервалы. Содержание сахара оценивается по методу
Антрона, а белка–по методу Фолина-Лоури.
22.6. Тестирование EPS/GP для индукции реакции WS
Необходимый Материал
ЭПС видов теста бактериальных, дистиллированной стерильной воды,
подкожного шприца, завода хозяина теста, меток, и так далее.
182
Методика
Необходимо следовать протоколу, данному Боркаром и Вермой (1989а).
Растворите 10 мг ЭПС в 1 мл дистиллированной стерильной воды и сделайте
последовательные разведения до 10-10. Инокулят измеренное количество
разведений ЭПС из вышеуказанных серийных разведений в дорсальную
сторону листьев тестируемого растения-хозяина с помощью подкожного
шприца. Инкубируйте растения во влажных камерах и наблюдайте за
развитием и сохранением реакции WS со стороны ЭПС до 3 дней.
Оцените количество ИПС, необходимое для индукции реакции WS, и
количество ЭПС, необходимое для стойкого WS.
183
23. ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
Бактерии выделяют и высвобождают определенные метаболиты,
которые помогают им получать питательные вещества из окружающей среды,
играть роль в распаде тканей хозяина и развитии симптомов или выживать в
конкурентной среде обитания. Эти метаболиты могут быть ферментами,
токсинами, бактериоцинами и так далее.
23.1. Извлечение общего культурального фильтрата
Методика
Экспоненциально-фазовую культуру вирулентного штамма патогенной
бактерии исследуемого растения выращивают в среде производства
полисахаридов (K2HPO4, 1,2 г; KH2PO4, 0,8 г; MgSO4,7H2O, 0,2 г; пептон, 5
г; сахароза, 5 г; дистиллированная вода, 1 л; рН 6,8 в течение 5 дней при 30°С
на вращающемся шейкере. Бактериальные клетки собирают
центрифугированием (250 Гц, 2 ч, 4°C), и полученный таким образом
супернатант называют общим культуральным фильтратом (TCF).
Экстракция растворителем TCF: Уменьшите TCF (200 мл) до 50 мл во
вращающемся испарителе в вакууме при температуре 60°C и извлеките 5 мл
TCF на 10 мл растворителя индивидуально диэтиловым эфиром, бутанолом и
хлороформом. Храните различные фазы растворителя асептически при
температуре 4°C до дальнейшего использования. Выпаривают экстракты
растворителей в вакууме и растворяют в 5 мл стерилизованной воды перед
использованием на испытательной установке Borkar and Verma (1989b).
23.2. Выделение бактериальных токсинов
23.2.1. Неспецифические токсины хозяина
23.2.1.1. Табтоксин
Его продуцирует Pseudomonas syringae pv. tabaci, возбудитель лесной
болезни табака. Токсин участвует в производстве симптомов лесной болезни
на листьях табака, проявляя некротические пятна, окруженные желтым
ореолом. Идентичные симптомы заболевания могут быть вызваны
184
культуральным фильтратом бактерий или очищенным токсином. Подобные
эффекты могут наблюдаться на относительно широком спектре хозяев, что
делает токсин неспецифичным для хозяина. Табтоксин химически
представляет собой дипептид, состоящий из аминокислот треонина и
табтоксинина. В клетке табтоксин расщепляется, высвобождая часть
табтоксинина, которая является активным токсином в ингибировании
фермента глутаминсинтетазы, и это основной способ действия токсина.
Методика
Выращивают бактерию в питательном бульоне в течение 4-5 дней на
вращающемся шейкере при температуре 27 ± 2°С. Центрифугируют при 10000
× g в течение 10 минут для сбора супернатанта. Пропустите супернатант через
катионообменную смолу, чтобы поглотить токсин на смоле. Извлеките токсин
из смолы элюированием 5% аммиака. Очищают токсин методом ионообменной
хроматографии.
Примечание: Табтоксин трудно использовать, потому что он химически
нестабилен. Это происходит из-за лабильной группы B-лактума в одном из
аминокислотных остатков. Табтоксин медленно теряет биологическую
активность в водном растворе с образованием неактивного изомераизотабтоксина. Изомеризация или инактивация токсина минимальна в
диапазоне рН 3-5 и при низких температурах, но усиливается при более
высоких значениях рН (7,7) и более высоких температурах.
23.2.1.2. Фазеолотоксин
Его продуцирует Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, возбудитель галофитофтороза бобов. Токсин участвует в индуцировании симптомов галофитофтороза на бобах. Химически токсин представляет собой трипептид
орнитин–аланин–аргинин с фосфосульфинильной группой. В клетках токсин
ферментативно расщепляется, высвобождая фосфосульфинилорнитин,
который является токсичным компонентом; клеточные эффекты являются
результатом инактивации фермента орнитинкарбамолитрансферазы.
185
Методика
Выращивают бактерию в питательном бульоне в течение 4-5 дней на
вращающемся шейкере при температуре 27 ± 2°С. Центрифугируйте при 10000
× g в течение 10 минут для сбора супернатанта. Трехступенчатая очистка
обычно используется для фазеолотоксина.
Адсорбция на древесном угле: Культуральный супернатант пропускают
через колонку древесного угля, промывают водой и извлекают из него
фазеолотоксин экстракцией метанолом-хлороформом-0,5 Мас. аммиаком
(3:1:1). Проводят ионообменную колоночную хроматографию на GAEсефадексе с использованием градиентного элюирования бикарбонатом
аммония и разделительную колоночную хроматографию на LHZO-сефадексе с
использованием метанола -0,05 М водного аммиака (1:1).
Основным требованием при манипулировании фазеолотоксином
является контроль рН при нейтральных или слабощелочных значениях, чтобы
поддерживать химическую стабильность токсина. При рН<3 фазеолотоксин
очень лабилен. Растворы аммонийной соли фазеолотоксина очень лабильны.
Растворы аммиачной соли фазолотоксина, полученные из этой
последовательности очистки, химически стабильны при охлаждении (вода или
метанол-вода 1:1).
23.3. Выделение бактериальных ферментов
Клеточные стенки растений в основном состоят из полисахаридов.
Простой, но важный патогенный механизм в растениях включает деградацию
клеточной стенки батареей ферментов, секретируемых патогенами.
Большинство производных ферментов представляют собой гликозидные
гидролизы, которые разрушают целлюлозную и пектатную матрицы путем
добавления воды для разрушения гликозидных связей. Пектатная сеть также
разрушается полисахаридными лиазами, которые расщепляют гликозидные
связи с помощью механизма В-элиминации.
186
23.3.1. Выделение целлюлаз
Целлюлоза-это длинноцепочечный полимер глюкозы, связанный
посредством гликозидных связей с b1, 4 связями, в которых углерод номер
один (№1) на глюкозной связи связан с углеродом № 4 на второй глюкозе. Он
является основным компонентом клеточной стенки растений. Расщепление
целлюлозы происходит под действием целлюлаз-группы ферментов,
гидролизующих гликозидные связи в1-4 или их производные. Гидролиз
целлюлозы в конечном итоге приводит к образованию глюкозы, которая
является важным источником энергии для патогенных микроорганизмов, а
вследствие гидролиза целлюлозы клеточные стенки теряют свою прочность и
разрушаются.
Данный эксперимент посвящен продуцированию патогеном
внеклеточной целлюлазы in vitro и in vivo и тестированию активности
различных ее компонентов (эндоглюканазы или экзоглюканазы и целлобиазы).
Разнообразная группа грибов и несколько бактерий продуцируют
целлюлазу в питательной среде бульона, содержащего целлюлозу.
23.3.1.1. Извлечение целлюлазы из патогена (In Vitro)
Необходимый материал
Тест-бактериальная культура, жидкая среда Чапека (содержащая 2-3%
карбоксилметилцеллюлозы или целлюлозного порошка) рН 6,5, центрифуга,
500 мл колбы Эрленмейера, воронка Бюхнера, фильтровальная бумага Ватмана
№ 1, диализные трубки, спиртовая лампа/горелка Бунзена.
Методика
Налейте 100 мл отвара Чапека в каждую 500-мл колбу и заткните ватной
пробкой. Автоклавируйте их при температуре 15 фунтов на квадратный дюйм
в течение 15 минут. Асептически инокулируйте колбы тестовыми
бактериальными культурами. Инкубируют инокулированные колбы при
комнатной температуре (25°С) в течение 7 дней. Собирают бактериальные
клетки центрифугированием при 10000 × g и собирают супернатант. Вылейте
187
супернатант в диализные пробирки и диализируйте фермент против
дистиллированной воды при температуре 2-4°C в течение 8 часов.
Тестирование на наличие фермента целлюлазы
Подготовьте микротомный срез тканей листьев доступного растения.
Поместите несколько секций в изолированный раствор фермента, а несколько
секций поместите в дистиллированную воду на 8-10 часов. Сделайте
микроскопические наблюдения за разрушением структуры клеточной стенки в
образце или следуйте процедуре, описанной в разделе 3.3.1, чтобы наблюдать
деградацию целлюлозы в клеточной стенке. Деградация клеточной стенки
указывает на присутствие в препарате фермента целлюлазы.
Прозрачный диализированный раствор (или недиализированный
раствор) в качестве источника фермента может быть использован для
различных тестов. Его можно хранить при температуре 2-4°C, когда он не
используется, после добавления нескольких капель толуола.
23.3.1.2. Извлечение фермента целлюлазы из больных растений (In Vivo)
Целлюлазы вырабатываются несколькими фитопатогенными грибами и
бактериями. В живых тканях они играют важную роль в размягчении или
распаде материала клеточной стенки, тем самым облегчая проникновение и
распространение патогена. Извлечение целлюлаз производится из зараженного
растения-хозяина.
Необходимый материал
Образцы бактериальной инфекции, блендер Варинга, пестик и ступка,
центрифуга, марля, воронка, 100-мл колба Эрленмейера, диализные трубки,
скальпель/лезвие бритвы.
Методика
Возьмите 25 г инфицированной ткани бактериальной болезни, где
структуры клеточной стенки разрушаются из-за бактериальной инфекции.
Разрежьте ткань на кусочки размером 1-2 см. Переложите его в блендер
варинга. Добавьте 100 мл дистиллированной воды или уксусно–ацетатного
буфера при рН 5,2. Перемешивайте в течение 5-10 минут. Процедить через два
188
слоя марли. Центрифугируют при 2000 г при температуре 35°С в течение 20
минут. Возьмите супернатант в диализные пробирки и диализируйте его
против дистиллированной воды при температуре 2-4°C в течение 8 часов.
(Диализа в течение более длительного периода можно избежать, поскольку он
снижает активность фермента целлюлазы.)
Тестирование на наличие фермента целлюлазы
Тестирование на наличие ферментной целлюлозы может быть проведено,
как описано ранее или как описано в разделе 3.3.1. Прозрачный
диализированный раствор в диализной трубке (или сырой фермент в колбе)
является ферментом, который может быть использован для различных тестов.
Его можно хранить при температуре 2-4°C, добавляя несколько капель толуола,
когда он не используется.
Особенности
Для достижения наилучших результатов работайте при низкой
температуре (2-4°C). Диализа можно избежать, потому что некоторые
ферменты всасываются в трубку во время диализа и снижают активность
целлюлазы. Охлажденный буфер следует использовать для извлечения
фермента.
23.3.1.3. Измерение эндоглюканазы
Эндо б-1-4–глюканаза (или CMCase), продуцируемая внеклеточными
микробами, случайным образом атакует в-1-4–гликозидные связи молекулы
целлюлозы и приводит к высвобождению редуцирующих сахаров. Они
поглощаются клеткой микроба и используются для производства энергии для
их метаболической деятельности.
Анализ CMCase проводится путем спектрофотометрической оценки
восстановительных сахаров с использованием реагента динитросалициловой
кислоты (DNS).
Необходимый материал
Источник фермента (культуральный фильтрат или экстракт больной
ткани), пробирки (18 × 150 мм), пипетки по 1 мл и 5 мл, ванны с горячей водой
189
(при 37°С и 100°С), натриевый ацетатно–уксусный буфер, рН 5,2. 1%
карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ; приготовлена в ацетатном буфере при рН
5,2), спектрофотометр (spectronic 20), 250 мл мензурка, реагент
динитросалициловой кислоты (ДНС), 40% раствор соли Рошеля.
Методика
Приготовьте реагент DNS, растворив 1 г DNS, 200 мг кристаллического
фенола и 50 мг сульфата натрия в 100 мл NaOH (1%). Приготовьте 40процентный раствор тартарата калия-натрия (соль Рошеля). Пипеткой в
пробирку вводят 1 мл КМЦ, затем 1 мл буфера и 2 мл фермента. Держите
пробирку с реакционной смесью на водяной бане при температуре 37°C в
течение 30-120 минут.
Пипеткой 1 мл реакционной смеси заливают в пробирку после 30минутной инкубации. Добавьте 1 мл реагента DNS в вышеуказанную
пробирку. Держите смесь на кипящей водяной бане в течение 5 минут или до
появления цвета. Добавьте 1 мл соли Рошель (40 процентов), пока смесь еще
теплая. Охладите трубку под водопроводной водой.
Измерьте поглощение раствора при 575 нм на спектрофотометре.
Повторите те же процессы извлечения 1 мл аликвоты реакционной смеси с
интервалом 60, 90 и 120 минут для проведения теста.
Рассчитайте количество редуцирующих сахаров, выделяющихся в
реакционной смеси через определенные промежутки времени, используя
стандарт, приготовленный из глюкозы. Выражают активность фермента как
количество выделенной глюкозы/мл ферментного экстракта/единицу времени.
23.3.2. Пектиназы или пектолитические ферменты патогенов
Пектиновые вещества, состоящие в основном из единиц галактуроновой
кислоты (связанных ана-1, 4 способом), находятся в первичной клеточной
стенке растения и средней пластинке. Разложение их осуществляется
микробными ферментами,которые делятся на три основные категории:
гидролитические (PG, PMG), трансэлиминативные (PTE, PATE) и
пектиноэстеразы (PME). Эти ферменты секретируются инфицирующим
190
паразитом или активируются в тканях во время инфекции и, как полагают,
играют важную роль в патогенезе/развитии заболевания. Патогены выделяют
ферменты либо индуктивно, то есть только при наличии своего субстрата,
называемого индуцированными (или индуцибельными) ферментами, либо
неиндуктивно, то есть независимо от наличия своего субстрата, называемого
конститутивными ферментами как в культуральных средах, так и в
инокулированных растениях.
Некоторые из пектолитических ферментов (PG, PME, PTE, PATE) могут
быть индивидуально проанализированы с использованием соответствующих
субстратов.
23.3.2.1. Извлечение пектолитических ферментов из больных растений
(In Vivo)
Пектолитические ферменты играют важную роль в патогенезе/развитии
заболевания и вырабатываются в инфицированных тканях растений. Они могут
быть извлечены либо из частей растения, проявляющих симптомы
определенной болезни, либо из намеренно зараженных частей растения.
Извлечение сырых пектиновых ферментов производится из инокулированных
эрвинией клубней/корневищ колокацеи.
Необходимый материал
Эрвиния-инокулированные клубни колокацеи, здоровые клубни
колокацеи, блендер/пестик и ступка, 5-мл пипетка, мензурка (250 мл), NaCl
(0,15 м), толуол, марля, целлофановые пробирки, центрифуга.
Методика
Возьмите 20 г зараженных эрвинией (естественно или искусственно
привитых) клубней колокацеи. Переложите материал в блендер варинга и
добавьте 100 мл 0,15 М NaCl. Смешайте в течение 2 минут. Процедить через
два слоя марли. Перенесите фильтрат в центрифужные пробирки. Запустите
центрифугу при 2000 g в течение 30 минут. Возьмите супернатант в
целлофановые пробирки и диализируйте его против дистиллированной воды
при температуре 4°C в течение 24 часов, меняя воду каждые 8 часов.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]