Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
281
стерильной дистиллированной воды и количественно измерьте ее с помощью
спектрофотометра на длинах волн 260 и 280 нм. Выделенную геномную ДНК
количественно оценивают соответствующим образом, разбавляют до
получения эквимолярной рабочей концентрации 40-100 нг/мкл, которая
используется в качестве матрицы для ПЦР-амплификации.
31.1.2. Выделение бактериальной плазмидной ДНК
Метод включает лизис бактериальной клетки подходящим детергентом
(SDS). Воздействие бактериальной суспензии на сильно ионный детергент при
высоком рН вызывает разрыв клеточной стенки, разрыв геномной ДНК на
части (прикрепляясь к клеточной стенке) и денатурацию белков. Используемая
щелочь (NaOH) вызывает денатурацию как плазмидной, так и хромосомной
ДНК. Плазмида, будучи ковалентно замкнутыми нитями, остается
переплетенной даже после денатурации и облегчает ренатурацию, когда
условия возвращаются к норме после добавления нейтрализующего раствора.
Бактериальные белки, разрушенная клеточная стенка и денатурированная
хромосомная ДНК объединяются в большой комплекс, покрытый
додецилсульфатом. Эти комплексы белковых остатков вместе с геномной ДНК
эффективно гранулируются из раствора центрифугированием. Далее нативную
плазмидную ДНК можно извлечь из супернатанта путем осаждения двумя
объемами этанола в присутствии 0,3 М ацетата калия с последующей
инкубацией в глубокой морозильной камере и центрифугированием.
Необходимые материалы
Буферы и решения: Стоковые решения. 50% глюкозы (200 мл).
Растворите 100 г глюкозы (декстрозы) в 150 мл дистиллированной воды.
Составьте до 200 мл и автоклав.
1 М Трис–HCl рН 8,0 (500 мл): Растворить 60,55 г Трис в 400 мл
дистиллированной воды. Отрегулируйте рН до 7,5 с помощью
концентрированного HCl. Составьте объем до 500 мл.
0,5 М ЭДТА рН 8,0 (100 мл): Растворить 16,8 г безводной динатриевой
соли в дистиллированной воде. Отрегулируйте рН до 8,0 с помощью гранул
282
NaOH. Больше ЭДТА растворится, когда рН приблизится к 8,0. Составьте
объем до 100 мл и автоклавируйте.
10% SDS (100 мл) (w/v): Растворите 10 г в 100 мл дистиллированной
воды. Осторожно нагрейте, чтобы SDS попал в раствор.
1 Н гидроксида натрия (100 мл): Растворить 4 г в 100 мл
дистиллированной воды.
5 М ацетата калия (500 мл): Растворить 245,5 г в 400 мл
дистиллированной воды. Отрегулируйте рН до 5,5 с помощью ледяной
уксусной кислоты. Составьте объем до 500 мл.
Методика
Подготовка клеток: Инокулят 2 мл среды LB, содержащей
соответствующий антибиотик, с одной колонией трансформированных
бактерий. Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 27°C с
энергичным встряхиванием, чтобы убедиться, что культура достаточно
аэрирована: объем культуральной трубки должен быть по крайней мере в
четыре раза больше объема бактериальной культуры. Трубка должна быть
свободно закрыта. Культуру следует инкубировать при сильном
перемешивании. Налейте 1,5 мл культуры в пробирку с микрофугой.
Центрифугируйте на максимальной скорости в течение 30 секунд при
температуре 4°C в микрофуге. Храните неиспользованную часть исходной
культуры при температуре 4°C. Когда центрифугирование будет завершено,
удалите среду, оставив бактериальную гранулу как можно более сухой.
Лизис клеток: Ресуспендировать бактериальную гранулу в 100 мкл
ледяного щелочного лизисного раствора I путем энергичного вихревания.
Убедитесь, что бактериальная гранула полностью диспергирована в щелочном
растворе лизиса I. Добавьте 200 мкл свежеприготовленного щелочного
лизисного раствора II к каждой бактериальной суспензии. Плотно закройте
пробирку и перемешайте содержимое, быстро перевернув пробирку пять раз.
Не завихряйтесь. Храните тюбик на льду. Убедитесь, что вся поверхность
трубки соприкасается с раствором щелочного лизиса II.
283
Добавьте 150 мкл ледяного щелочного лизисного раствора III. Закройте
пробирку и диспергируйте щелочной лизисный раствор III через вязкий
бактериальный лизат, перевернув пробирку несколько раз. Храните пробирку
на льду в течение 3-5 минут.
Центрифугируйте бактериальный лизат на максимальной скорости в
течение 5 минут при температуре 4°C в микрофуге. Перенесите супернатант в
свежую пробирку.
Необязательно: Добавьте равный объем фенола:хлороформ. Смешайте
органическую и водную фазы путем вихревого перемешивания, а затем
центрифугируйте эмульсию на максимальной скорости в течение 2 минут при
температуре 4°C в микрофуге. Перенесите водный верхний слой в свежую
пробирку.
Восстановление плазмидной ДНК: Осаждение нуклеиновых кислот из
супернатанта путем добавления 2 объемов этанола при комнатной
температуре. Смешайте раствор путем вихревого перемешивания, а затем
дайте смеси постоять в течение 2 минут при комнатной температуре.
Соберите осажденные нуклеиновые кислоты центрифугированием на
максимальной скорости в течение 5 минут при температуре 4°С в микрофуге.
Удалите супернатант. Поставьте трубку в перевернутом положении на
бумажное полотенце, чтобы вся жидкость вытекла.
Добавьте 1 мл 70-процентного этанола в гранулу и переверните
закрытую пробирку несколько раз. Восстанавливают ДНК
центрифугированием с максимальной скоростью в течение 2 минут при
температуре 4°С в микрофильтре. Снова удалите весь супернатант. Будьте
осторожны с этим шагом, так как гранула иногда не плотно прилипает к трубке.
Удалите все шарики этанола, которые образуются по бокам трубки.
Храните открытую пробирку при комнатной температуре до тех пор, пока
этанол не испарится и в пробирке не появится жидкость (5-10 минут).
284
Растворите нуклеиновые кислоты в 50 мкл ТЕ (рН 8,0). Осторожно
перемешайте раствор в течение нескольких секунд. Храните раствор ДНК при
температуре -20°C.
31.2. Методы, основанные на профилировании плазмид
Плазмиды-это несущественные внехромосомные кольцевые молекулы
ДНК, присутствующие в прокариотах, что дает им дополнительные
преимущества, такие как устойчивость к противомикробным препаратам или
гены вирулентности. Они размножаются автономно и имеют диапазон
размеров от нескольких до нескольких сотен килограммовых пар оснований
(кб).
31.2.1. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК
Известно, что большинство патогенных бактерий растений содержат
плазмиды, несущие гены, ответственные за вирулентность, устойчивость к
антибиотикам и выработку экзополисахаридов (Sundin, 2007). Эти плазмиды
часто имеют большие размеры, что затрудняет характеристику плазмид
простым электрофорезом в агарозном геле. При рестрикционном анализе
плазмидной ДНК большая плазмидная ДНК редуцируется до ряда более
мелких фрагментов определенного размера при переваривании с
рестрикционной концевой нуклеазой. Концевые нуклеазы рестрикции-это
бактериальные ферменты, которые связывают и расщепляют ДНК в
определенных целевых последовательностях. Они связывают ДНК в
определенном месте распознавания, состоящем из короткой палиндромной
последовательности, и расщепляются в этом месте, образуя либо липкие, либо
тупые продукты расщепления. Количество полученных таким образом
фрагментов и размер каждого фрагмента отражают распределение сайтов
рестрикции и общий размер плазмидной ДНК. Полученный таким образом
фрагмент будет специфичен для каждой комбинации плазмидной ДНКмишени и фермента рестрикции и может быть использован в качестве
отпечатка пальца, специфичного для данной плазмидной ДНК-мишени.
285
Дактилоскопирование плазмидной ДНК выявляет более высокий полиморфизм
и происходит быстрее, чем РФЛП-анализ геномной ДНК.
Процедура профилирования плазмид может одновременно нацеливаться
на ассоциированные с патогенностью локусы, поэтому этот метод
чувствителен при обнаружении патогена. Профилирование плазмид также
доказало их роль в следующих исследованиях, таких как разнообразие,
эпидемиологическая дифференциация, взаимодействие хозяина и патогена,
вирулентность и устойчивость/восприимчивость к антибиотикам. Algeria et al.
(2005) заметили, что Xanthomonas axonopodis pv. citri содержит два кластера
генов virB, один на хромосоме, а другой на 64-кб плазмиде, каждый из которых
кодирует ранее нехарактерную систему секреции IV типа.
Местные мега-плазмиды были зарегистрированы у различных видов
ксантомонад с размерами от 7 до 100 кб (Pruvost et al., 1992). Kale et al. (2012)
наблюдали, что при профилировании плазмид Xanthomonas axonopodis pv.
punicae было обнаружено, что приблизительный композитный размер этих
плазмид находится в диапазоне от 94 до 96 кб, что совпадает с данными о двух
плазмидах, то есть ~100 кб (60-65 кб и 34-40 кб) от других патогенов
Xanthomonas axonopodis (Satyanarayana and Verma, 1993; da Silva et al., 2002).
Сатьянараяна и Верма (1993) обнаружили, что высоковирулентные расы X.
axonopodis pv. malvacearum содержит по меньшей мере пять плазмид, среди
которых распространены две большие плазмиды размером 60 кб и 40 кб.
Наблюдалась большая вариабельность в меньших плазмидах, которые,
вероятно, были вовлечены в дополнительную агрессивность. X. axonopodis pv.
citri имеет две плазмиды (64,9 кб и 33,7 кб) (da Silva et al., 2002); X. axonopodis
pv. vesicatoria 85-10, вызывающая бактериальное пятно перца и помидора,
имеет 4 плазмиды (182 кб; 38 кб; 19 кб и 1,9 кб); в то время как у X. oryzae pv.
oryzae плазмид не наблюдалось (Lee et al., 2005).
Необходимые материалы и реагенты
Агароза; бычий сывороточный альбумин (BSA; 10 мг/мл); дитиотреитол,
20 × (DTT; 20 мм); бромид этидия (10 мг/мл); лед; маркеры размера HindIII,
286
концентрация, предоставленная производителем (~0,5 мкг/мл);
микроцентрифужные пробирки (0,5 мл); образцы ПЦР-реакции; плазмидная
ДНК pRY 121 от maxi-prep; плазмидная ДНК pRY 121 от mini-prep; буферы
рестрикционных ферментов, 10 × (производители поставят рекомендуемый
буфер с ферментом).
Ферменты рестрикции: HindIII, PstI, BamHI, EcoRI (в глицерине).
Стоп-буфер: 200 мМ ЭДТА (рН 8,0). ТАЭ-буфер (25×: 1 м Трис, 15 мМ
ЭДТА, 125 мМ ацетат натрия (рН 7,8). К 750 мл дистиллированной H2O
добавляют 121 г Трис-основания, 10,2 г ацетата натрия и 18,6 г ЭДТА.
Отрегулируйте рН до 7,8 с помощью ледяной уксусной кислоты и доведите
объем до 1 л. Храните при температуре 4°C. Следящий краситель, 6 × (на 100
мл 6 × исходного раствора добавляют 40 г сахарозы к 60 мл дистиллированной
H2O. Добавьте 250 мг бромфенолового синего. Перемешайте, помешивая, в
течение 15-20 минут. Хранить при температуре 4°C. Этот 6-кратный раствор
красителя добавляют в одну шестую конечного объема раствора ДНК,
подлежащего электрофорезу).
Оборудование и пластиковая посуда: колбы Эрленмейера (250 мл),
перчатки, лабораторная лента, микропипетка и наконечники, пастеровская
пипетка, Полароидная пленка (тип 667), полиэтиленовая пленка, контейнеры
Tupperware (или эквивалент) для окрашивания, термоблок при температуре
65°С, горизонтальный аппарат гелевого электрофореза, микроцентрифуга,
микроволновая печь или горелка Бунзена, ультрафиолетовый (УФ)
трансиллюминатор, водяная баня.
Методика
Рекомендации по подготовке плазмидной ДНК для рестрикционного
переваривания: Определите количество плазмидной ДНК, подлежащей
перевариванию (т. е. Исходя из концентрации запаса (единиц на микролитр)
эндонуклеазы рестрикции, рассчитайте микролитры фермента, необходимые
для достижения переваривания желаемого количества ДНК. Для этого
эксперимента достаточно 2 единиц фермента, чтобы переварить 1 мкг
287
плазмидной ДНК. (Примечание: 6 единиц/мкг-это эмпирическое правило для
переваривания хромосомной ДНК.) Так как использование избыточного
фермента обеспечивает полное переваривание. Определите общий объем
реакции переваривания для достижения соответствующего объема, в котором
содержание глицерина в реакции будет меньше или равно 5 процентам (v/v).
Обычно нуклеазы рестрикции поставляются в 50-процентном (v/v) глицерине,
так что разведения фермента 1:10 в конечной реакционной смеси будет
достаточно. Для некоторых ферментов бычий сывороточный альбумин (БСА)
необходим в качестве стабилизатора для оптимального пищеварения. Разумно
проверить, требует ли фермент BSA или нет, прежде чем переваривать.
Рассчитайте количество ингредиентов, которые будут использоваться в
каждом из следующих рестрикционных дайджестов: (1) pRY121 (mini-prep) cut
with BamHI, (2) pRY121 (maxi-prep) cut with HindIII, (3) pRY121 (maxi-prep) cut
with EcoRI, (4) pRY121 (maxi-prep) cut with PstI и (5) pRY121 (maxi-prep) cut
with BamHI. (См. Таблицу 31.1.)
Используйте микропипетку для дозирования ингредиентов в 0,5-мл
микроцентрифужную пробирку. Используйте свежий стерильный наконечник
для каждого ингредиента, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Фермент должен быть при температуре -20°C до использования и должен быть
добавлен последним. Все остальные ингредиенты должны храниться на льду.
Буфер для хранения ферментов очень вязкий и будет прилипать к внешней
стороне наконечника микропипетки. Чтобы обеспечить точность, самый
кончик пипетки должен просто касаться поверхности при составлении
раствора фермента. Смешайте дайджест, осторожно щелкнув
микроцентрифужной трубкой. Не завихряйтесь. Гранулируйте любые капли,
вращая трубку в течение 3 секунд в микроцентрифуге на максимальной
скорости. Инкубируйте дигесты при температуре 37°С на водяной бане в
течение 1 часа. Выньте реакционные трубки из водяной бани и удалите
конденсат в трубках центрифугированием в течение 3 секунд на максимальной
скорости в микроцентрифуге.
288
Этот шаг необязателен. Добавьте 1 мкл 200 мм ЭДТА-стоп-буфера (рН
8,0). Инактивация ферментов рестрикции хелатированием металлических
кофакторов предотвращает аномальные эффекты из-за чрезмерного
воздействия ДНК на активный фермент. Для некоторых концевых нуклеаз
рестрикции рекомендуются другие стадии инактивации (например, нагревание
при 65°C в течение 10 минут). Приготовьте стандарт молекулярной массы,
добавив 1 мкл (0,5 мкг/мл) сырья к 19 мкл дистиллированной воды. Добавьте 4
мкл 6 - кратного раствора отслеживающего красителя ко всем образцам.
Вращайте трубки в течение 3 секунд на максимальной скорости в
микроцентрифуге. Нагрейте образцы при температуре 65°C в тепловом блоке
в течение двух минут, чтобы диссоциировать агрегаты ДНК. Запустите
рестрикционные переваренные образцы на 0,8-процентном агарозном геле.
31.2.2. Типизация реплик
Принцип ПЦР-типирования репликонов (Carattoli et al., 2005): Плазмиды
автономно реплицируют круговую внехромосомную ДНК у прокариот. Для
классификации и идентификации плазмид используется система репликации
плазмид, которая диктует поведение плазмиды (диапазон хозяина, номер
копии). Плазмиды первоначально классифицируются в группы
несовместимости (Inc) на основе общности регуляторов репликации (Novick,
1987).
Стандартная процедура определения групп Инк является трудоемкой,
требующей многократного анализа конъюгации или трансформации (Datta and
Hedges, 1971). Эта методология не может быть легко применена к большому
количеству штаммов, поскольку их применение было ограничено трудоемкой
и трудоемкой работой. Если резидентная плазмида элиминируется в потомстве,
входящая плазмида присваивается той же группе Инк. Плазмиды с одним и тем
же контролем репликации “несовместимы”, тогда как плазмиды с различными
регуляторами репликации “совместимы”. На этом основании две плазмиды,
принадлежащие к одной и той же группе Инк, не могут размножаться в одной
и той же клеточной линии (Datta and Hughes, 1983; Couturier et al., 1988).
289
Идентификация группы Инк часто использовалась для классификации
плазмид. В 1988 году Кутюрье и др. разработали новый метод распознавания
репликонов FIA, FIB, FIC, HI1, HI2, I1-Ig, L/M, N, P, W, T, A/C, K, B/O, X, Y, F
и FIIA, представляющих основные группы несовместимости плазмид,
циркулирующие среди энтеробактерий. Они проверили специфичность метода
на 61 референтной плазмиде методом ПЦР-типирования inc/rep. ПЦР-детекция
плазмид также была разработана на основе опубликованных
последовательностей, но она ограничена плазмидами IncP, IncN, IncW и IncQ
(Gotz et al., 1996).
Метод ПЦР-типирования Inc/rep: Матричная плазмидная ДНК готовится
описанным ранее методом. Для этого требуется примерно 200 нг общей ДНК
на одну реакцию.
Специфические пары праймеров разрабатываются для различных
репликонов с помощью программного обеспечения Primer3 на основе
опубликованных последовательностей различных присоединений Банка генов
(см. http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Эти пары праймеров распознают либо
кодирующую последовательность генов репликазы repA, либо цис-повторы
сайта ori (происхождение репликации), либо встречный транскрипт RNAI,
либо гены parA–parB, контролирующие секционирование плазмид, либо
репликоны плазмид вирулентности.
Основанный на ПЦР метод типирования Inc/rep состоит из комбинации
различных мультиплексных ПЦР,распознающих различные типы репликонов,
а также симплексных ПЦР каждого типа репликонов. Все ПЦР-амплификации
проводят по следующей схеме амплификации: 1 цикл денатурации при 94°С в
течение 5 минут, затем 30 циклов денатурации при 94°С в течение 1 минуты,
отжиг при 60°С в течение 30 секунд и удлинение при 72°С в течение 1 минуты.
Амплификация завершается программой расширения 1 цикла при 72°C в
течение 5 минут. Следует отметить результаты метода ПЦР на основе Inc/rep
на плазмидах известных групп несовместимости.
290
31.3. Методы, основанные на гибридизации
Основная концепция целевого комплементарного зонда,
сигнализирующего о присутствии цели в случае гибридизации, является
широко используемым методом визуализации цели. Классические методы
Southern и Northern blot переносили фрагменты гель-электрофореза на
мембранный фильтр со специфичными для целевой последовательности
мечеными зондами для детекции ДНК и РНК соответственно. Точно так же
была разработана методика Вестерн-блота для обнаружения белков,
промокнутых с помощью меченых зондов, показывающих сродство к целевым
белкам, таким как комплементарные антитела.
31.3.1. Техника соузерн-блоттинга
Соузерн-блоттинг - это метод, используемый для идентификации
определенных последовательностей ДНК. Обычно более крупные фрагменты
ДНК (геномная ДНК) превращаются в удобно мелкие фрагменты с помощью
рестрикционного анализа. Затем их пропускают через агарозный гель.
Отделенные фрагменты в геле переносятся на нейлоновую мембрану
капиллярным переносом или вакуумным блоттингом. Интересующие
последовательности могут быть идентифицированы путем гибридизации с
использованием радиоактивных или нерадиоактивных зондов и
визуализированы с помощью авторадиографии или окрашивания.
Методика
Приготовление геля: Расщепление геномной ДНК с помощью
рестрикционной эндонуклеазы на тысячи фрагментов. Фрагменты разделяют
по размеру методом гель-электрофореза. Растягивает агарозный гель в
достаточном количестве воды при встряхивании при комнатной температуре.
Осторожно перенесите гель на 0,2 М HCl и встряхивайте в течение 10 минут
при комнатной температуре.
Фрагменты ДНК размером более 10 кб не переносятся эффективно на
блоттинговую мембрану. Чтобы облегчить их перенос, эти фрагменты
уменьшают в размерах либо путем депурирования, либо УФ-облучением. В
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]