Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
201
Вулли и аликвотах Ps. фильтрат культуры syringae ciccaronei, неочищенный
бактериоцин или фракция IV из колонки Sephadex G150 (1200 AU мл−1,
конечная концентрация) добавляют к культуре, которую инкубируют при 26°C.
Оптическую плотность (A600) культур измеряют через определенные
промежутки времени (спектрофотометр Beckman DU-65) и определяют
количество жизнеспособных бактериальных клеток на чашках с агаром KB.
23.4.3. Индукция продукции бактериоцина митомицином с
Выращивают Pseudomonas syringae ciccaronei в WP и NBY. Индуцируйте
культуры для выработки бактериоцина с помощью митомицина С (конечная
концентрация 0· 1 мкг мл−1), когда концентрация клеток достигнет примерно
3 × 108 клеток мл−1. После индукции культуры встряхивают при температуре
26°C в течение 4 часов, а затем хранят при температуре 4°C в течение ночи.
Удаляют остатки клеток центрифугированием (9000 г, 10 минут, 4°C) и
фильтруют, стерилизуют надосадочные жидкости и анализы на
антимикробную активность.
23.4.4. Определение антимикробной активности бактериоцина
Для выявления антагонистической активности Ps. syringae ciccaronei,
используют анализ методом отложенного определения на агаровом пятне
(Vidaver et al., 1972). Бактериальную суспензию (5 мкл; A600 нм, 0·3) штамма
точечно высевают на поверхность агара KB и инкубируют планшеты при 26°C
в течение 3d. Колонии уничтожают парами хлороформа и покрывают пластины
3 мл мягкого агара (агар 0·7% по массе), засеянного 100 мкл бактериальной
суспензии (A600 нм, 0·15) доступных штаммов. После 24 часов инкубации при
26°C ингибирование оценивается как положительное, если ширина прозрачной
зоны вокруг Ps. колонии syringae ciccaronei были размером 1·0 мм или больше.
Проведите анализы дважды в трех экземплярах.
Чтобы исключить активность бактериофагов, из зоны ингибирования
отбирают агаровые пробки и тестируют на присутствие бактериофагов
стандартными процедурами (Пагсли и Аудега, 1987).
202
Для оценки антимикробной активности Ps. фильтруют культуру syringae
ciccaronei, выращивают бактерию в среде WP в течение 4 дней. Нанесите
аликвоты (10 мкл) двухкратных последовательных разведений культурального
фильтрата на чашки с агаром KB и попробуйте в точечном анализе на агаре на
индикаторные штаммы.
23.5. Выделение сидерофора
Сидерофоры (греч. “носитель железа”)-это небольшие высокоаффинные
хелатирующие железо соединения, секретируемые микроорганизмами, такими
как бактерии. Сидерофоры являются одними из самых сильных растворимых
связывающих агентов Fe3+.
Железо необходимо почти для всех жизненных процессов, таких как
дыхание и синтез ДНК. Несмотря на то, что он является одним из самых
распространенных элементов в земной коре, биодоступность железа во многих
средах, таких как почва или море, ограничена очень низкой растворимостью
иона Fe3+. Это преобладающее состояние железа в водной, некислой,
насыщенной кислородом среде. Он накапливается в обычной минеральной
фазе, такой как оксид железа и гидроксид; следовательно, он не может быть
легко использован организмами или растениями. Некоторые растения, такие
как травы, в том числе ячмень, пшеница и овес, а также некоторые микробы
выделяют сидерофоры для извлечения железа из этих минеральных фаз путем
образования растворимых комплексов Fe3+, которые могут быть поглощены
активными транспортными механизмами.
Сидерофоры также важны для некоторых патогенных бактерий для
приобретения ими железа. Сидерофоры позволяют бактериям усваивать
железо в условиях ограниченной доступности этого элемента в окружающей
среде. Они отвечают за растворение, хелатирование и транспорт железа (III) в
клетку.
Бактерии часто заражают растения, попадая в ткани через устьица.
Проникнув в растение, они распространяются и размножаются в
межклеточных пространствах. При бактериальном сосудистом заболевании
203
инфекция распространяется внутри растений через ксилему. Оказавшись
внутри растения, бактерии должны иметь возможность извлекать железо из
двух основных транспортирующих железо легенд-никотианаминовой и
цитратной. Для этого они производят сидерофоры. Энтеробактерия Erwinia
chrysanthemi продуцирует два сидерофора - хризобактин и ахромобактин.
Известно, что Pseudomonas sp. продуцирует сидерофор, известный как
певердины. Флуоресцентные pseudomonas были признаны биоконтрольным
агентом против некоторых почвенных патогенов растений. Они производят
желто-зеленый пигмент (пиовердины), который флуоресцирует под
ультрафиолетовым светом и функционирует как сидерофоры. Они получают
железо, необходимое для их роста и патогенеза.
23.5.1. Анализ обнаружения сидерофоров
Метод, описанный Мастаном и др. (2014), заключается в следующем:
Производство сидерофоров изучают с использованием сукцинатной среды
(SM; Meyer and Abdullah, 1978), состоящей из следующих компонентов:
Янтарная кислота (4 г), K2HPO4 (6 г), KH2PO4 (3 г), (NH4)2SO4 (1 г), MgSO4
(0,2 г) и рН (7,0). В колбу объемом 250 мл, содержащую сукцинатную среду,
добавляют 0,1 мл инокулятов и инкубируют на орбитальном встряхивающем
инкубаторе в течение 48 часов при температуре 28°С. Для обнаружения
сидерофоров каждый изолят Pseudomonas выращивают в синтетической среде,
содержащей 0,5 м железа, и инкубируют в течение 24 часов на вращающемся
шейкере при комнатной температуре. Анализы, используемые для
обнаружения сидерофоров, - это анализ Хрома Азурола С и анализ Аткина.
Анализ агаровой среды Chrome Azurol S (CAS) (Schwyn and Neilands,
1987): Пластины CAS используются для проверки супернатанта культуры на
наличие сидерофоров. Культуральный супернатант добавляют в лунки,
сделанные на пластинах CAS-агара (маннит-10,0 г; глутамат натрия-2,0 г;
K2HPO4-0,5 г; MgSO4.7H2O-0,2 г; NaCl-0,1 г; дистиллированная вода-1000 мл;
рН 6,8–7,2) и инкубируют при комнатной температуре в течение 24 часов.
204
Образование желто - оранжевой зоны вокруг скважины указывает на
образование сидерофоров.
Примечание: Вся стеклянная посуда, используемая для хранения
исходного раствора среды, обрабатывается концентрированным HNO3.
Контейнеры погружали в концентрированный HNO3 и оставляли на ночь.
Через 24 часа кислоту удаляют, а стеклянную посуду тщательно промывают
двойной дистиллированной водой. Пластины CAS готовятся в три отдельных
этапа.
Приготовление индикаторного раствора CAS: Первоначально 60,5 мг
хрома азурола S растворяют в 50 мл двудистиллированной H2O. 10 мл раствора
Fe III (27 мг FeCl, 6H2O и 83,3 мл концентрированного HCl в 100 мл
двудистиллированной H2O) добавляют вместе с 72,9 мг
гексадецилтриметиламмония бромида (HDTMA), растворенного в 40 мл
двудистиллированной воды. Раствор HDTMA добавляют медленно при
перемешивании, в результате чего получается темно-синий раствор (общий
объем 100 мл), который затем автоклавируют.
Приготовление базальной агаровой среды: В колбе объемом 250 мл
растворяют 3 г 3-(N-Морфолино) пропансульфоновой кислоты (МОПС) (0,1
М), 0,05 г NaCl, 0,03 г KH2PO4, 0,01 г NH4Cl и 0,05 г L-аспарагинов в 83 мл
двойной дистиллированной воды. рН раствора доводят до 6,8 мл с помощью 6
М NaOH. Общий объем доводят до 88 мл с помощью двойной
дистиллированной воды и добавляют в раствор 1,5 г агара при перемешивании
и нагревании до расплавления. Затем раствор подвергают автоклавированию.
Приготовление пластин CAS-агара: Автоклавированную базальную
агаровую среду охлаждают до 50°C на водяной бане. Индикаторный раствор
CAS также охлаждают до 50°C вместе с 50-процентным раствором глюкозы.
После охлаждения в базальную агаровую среду при постоянном
перемешивании добавляют 2 мл 50-процентного раствора глюкозы, затем 10
мл индикаторного раствора CAS, который осторожно и медленно добавляют
вдоль стенок колбы при постоянном перемешивании. После тщательного
205
перемешивания полученный раствор (100 мл) разливают в стерильные тарелки.
При минимальных условиях железа образуются сидерофоры, которые
высвобождаются в питательную среду.
Для выделения и сбора сидерофоров выращивают изоляты Pseudomonas
в ограниченной железом (0,5 мл добавленного железа) синтетической среде и
синтетической среде с высокой концентрацией железа (20 мл). После 24 часов
роста культуру центрифугируют, а надосадочную жидкость без клеток
отделяют и собирают центрифугированием в течение 10 минут при 13500 об /
мин. Супернатант наносится на пластины CAS с помощью пробкового сверла,
чтобы сделать лунку на пластине. Надосадочную жидкость культуры
добавляют в лунку (60 мл), а пластины инкубируют при комнатной
температуре и наблюдают за развитием изменения цвета. Если сидерофоры
присутствуют, то виден оранжевый ореол. Гало образуется супернатантом
культур, выращенных в средах с ограниченным содержанием железа, в то
время как культуры, выращенные в условиях высокого содержания железа, не
вызывали никаких изменений цвета. В дополнение к использованию
супернатанта из культуры, выращенной в среде с высоким содержанием железа
в качестве контроля, неокулированную среду также добавляют в отдельную
лунку, чтобы убедиться, что сама по себе среда не вызывает изменения цвета.
% siderophore units + Ar − As _ 100 Ar
где Ar = поглощение эталона при 630 нм (реагент CAS) и As = поглощение
образца при 630 нм.
Оценка сидерофоров: Для изучения влияния концентрации железа и
различных источников углерода на продукцию сидерофоров культуры
выращивают в течение 40 часов при 25°С при встряхивании (200 об / мин) в
500 мл колб Эрленмейера, содержащих 125 мл среды, с рН, доведенным до 7.
Используются четыре базальные среды с добавлением FeCl3 в
увеличивающихся количествах (5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, и 300 г/мл).
206
Средства массовой информации содержат следующие компоненты (Meyer and
Abdallah, 1978):
Среда аспарагинов: Аспарагины 5 г/л, MgSO4 0,1 г/л и K2HPO4 0,5 г/л,
King, sB: Глицерин-10 г/л, Протеоза-пептон 20 г/л и MgSO4–1,5 г/л.
Глицериновая среда: Глицерин -10 г/л, (NH4) 2SO4–1 г/л, MgSO4.7H2O – 1 г/л,
K2HPO4 – 4 г/л.
Сукцинатная среда: KH2PO4– 6 г/л, K2HPO4–3 г/л, (NH4)2SO4– 1 г/л,
MgSO4.7H2O – 0,2 г/л, сукцинат натрия – 0,2 г/л.
23.5.2. Влияние концентрации железа, сахаров, органических и
аминокислот, азота на образование сидерофоров
1. Влияние концентрации железа: Для определения порогового уровня
железа, при котором подавляется биосинтез сидерофоров у исследуемых
Pseudomonas, культуры выращивают в СМ, внешне дополняя 1-100 мкм железа
(FeCl3.6H2O). После инкубации при температуре 29°С и 120 об / мин
оценивают рост и содержание сидерофоров.
Оптимизация производства сидерофоров: Среду SM готовят с различным
рН в диапазоне 2, 7, 10 и 14 и отдельно инокулируют культурами для проверки
влияния изменения рН на рост и продукцию сидерофоров.
2. Влияние сахаров, органических кислот и аминокислот: Для изучения
влияния различных сахаров, органических кислот и аминокислот на рост и
образование сидерофоров: в первом наборе каждые 100 мл СМ наружно
дополняют 1 г/л глюкозы, декстрозы, сахарозы, мальтозы и маннита. Второй
набор СМ индивидуально дополняется по 4,0 г/л лимонной и яблочной кислот.
Третий набор SM отдельно обогащен 1 г/л каждого из пролина, гистидина,
тирозина, треонина, цистеина и аланина. Каждый набор отдельно инокулируют
культурами и инкубируют. После 24-часовой инкубации при 29°C каждый
набор подвергают росту и количественному определению сидерофоров.
3. Влияние источников азота: В данном эксперименте сульфаты аммония
в СМ заменяют отдельно различными концентрациями мочевины (товарного
сорта) в диапазоне 0,1–1,0 г/л, а также нитрата натрия, соевой муки из расчета
207
1,0 г/л. Рост и продукция сидерофоров в этой среде сравниваются с таковыми
в СМ, содержащей сульфат аммония.
4. Влияние ионов других металлов: Для выявления влияния различных
тяжелых металлов на рост и образование сидерофоров культуры отдельно
выращивают в 100 мл СМИС с добавлением 10 мкм различных тяжелых
металлов, таких как ртуть (HgCl2), хлорид магния (MgCl2), хлорид кобальта
(CoCl2) и хлорид молибдена (MoCl2). После инкубации при температуре 29°С
и 120 об / мин оценивают рост и содержание сидерофоров.
23.5.3. Характеристика сидерофоров
Гидроксоматный тип сидерофоров определяют путем гидролиза 1 мл
супернатанта ночной выращенной культуры 1 мл 6N H2SO4 на кипящей
водяной бане в течение 6 ч или 130°С в течение 30 мин. Далее этот
гидролизованный образец буферизуют добавлением 3 мл раствора ацетата
натрия. К этому добавляют 0,5 мл йода и оставляют реагировать в течение 35
минут. После завершения реакции избыток йода уничтожают 1 мл раствора
арсената натрия. Наконец добавляют 1 мл раствора альфа–нафталина и дают
развиться цвету. Образование винно-красного цвета указывает на образование
гидроксаматного типа сидерофора (Gillan et al., 1981). При этом катехолятный
тип сидерофора определяют путем взятия 1 мл супернатанта в
завинчивающуюся пробирку. К этому добавляют 1 мл нитритно-молибдатного
реагента с 1 мл раствора NaOH. Наконец, добавляют 1 мл 0,5 Н HCl и дают
развиться цвету. Образование желтого цвета указывает на образование
сидерофора катехолятного типа (Arnow, 1937).
208
24. РОЛЬ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОМПОНЕНТА В
ИНДУКЦИИ РЕАКЦИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЛИ ПАТОГЕНЕЗЕ
Термин патогенез означает цепь событий, приводящих к заболеванию
вследствие ряда изменений в структуре или функции клетки/ткани/органа,
используемых микробным, химическим или физическим агентом. Патогенез
заболевания-это механизм, посредством которого этиологический фактор
вызывает заболевание. Существует несколько видов химического оружия,
секретируемого патогенами, которые используются патогеном для
уничтожения клеток-мишеней, чтобы получить питательные вещества для их
роста, размножения и выживания, что в конечном итоге приводит к
заболеванию хозяина.
24.1. Эпс в индукции реакции заболевания
Замачивание воды-первый симптом бактериальной инфекции. ЭПС
индуцирует реакцию замачивания воды в растении-хозяине, которая создает
влажность в ткани хозяина для размножения бактерий.
Необходимый материал
EPS, завод хлопка хозяина, пробел воды, шприц для подкожных
инъекций, ярлык, и так далее.
Методика
Растворите различные количества ЭПС в 5 мл дистиллированной
стерильной воды. Инфильтрируйте 0,2 мл этой суспензии ЭПС в хлопковые
листья с помощью шприца для подкожных инъекций. Поддерживайте растение
при температуре 27 ± 2°C с 80-процентной влажностью в условиях теплицы.
Запишите персистентность реакции WS в листьях растения-хозяина.
Минимальное количество ЭПС, необходимое для постоянного
замачивания воды в месте инокуляции/заражения, по-видимому, составляет 10
мг/мл (табл.24.1).
209
.
24.2. Бактериальные ферменты в индукции реакции заболевания
Кутиназа, целлюлаза, пектиназа и лигназа часто секретируются
патогенным организмом в специфической комбинации патоген–хозяин.
В комбинации патоген–хозяин первой поверхностью, с которой организм
вступает в контакт, является кутикула и клеточная стенка растения. Кутикула
состоит из сложного воска, кутина, который пропитывает целлюлозную
стенку. Клеточная стенка состоит из целлюлозы, которая составляет
структурный каркас стенки, наряду с матриксными молекулами
гемицеллюлозы, гликопротеина, пектина и лигнина. Поэтому проникновение в
живые паренхиматозные ткани и деградация средней пластинки достигается
секрецией и действием одного или нескольких ферментов, которые разлагают
эти химические вещества клеточной стенки хозяина.
Кутиназа разрушает кутин на слое кутикулы, чтобы предварительно
подготовить ткань к механическому проникновению в качестве первого шага
деградации ткани. По крайней мере, один вид бактерий продуцирует кутиназу.
Данные свидетельствуют о том, что кутиназы постоянно вырабатываются, хотя
и в низкой концентрации, причем продукт деградации часто индуцирует еще
более высокий уровень секреции кутиназы. У некоторых патогенов выработка
кутиназы может быть связана с вирулентностью.
210
Пектиновые вещества содержат среднюю пластинку и также образуют
аморфный гель между целлюлозными микроволокнами в первичной клеточной
стенке. Пектинодеструктивные вещества часто называют пектиназой или
пектолитическими ферментами, которые включают пектинометилэстеразу
(ПМЭ), полигалактуронзу (ПГ) и пектинолиазы или трансэлиминазу.
Пектиновая метилэстераза удаляет небольшие группы, такие как метильные
группы (СН3), часто изменяя растворимость и тем самым влияя на скорость
расщепления цепи полигалактуроназой и пектиновой лиазой.
Полигалактуроназа расщепляет цепи, добавляя молекулу воды, в то время как
пектин лизирует расщепленные цепи, удаляя молекулу воды из связи.
Пектинодеструктивные ферменты участвуют в широком спектре заболеваний
растений, в частности мягкой гнили, вызванной Erwinia carotovora, действие
пектиновых ферментов приводит к мацерации тканей, и эти ферменты
известны как мацерирующие ферменты.
Целлюлоза является основной каркасной молекулой клеточной стенки
растений, существующей в виде микроволокон с матричными молекулами
(гликопротеин, гемицеллюлоза, пектин, лигнин), заполняющими пространство
между микроволокнами и цепями целлюлозы. Было показано, что целлюлаза
вырабатывается бактериями. Целлюлозолитические ферменты играют важную
роль в размягчении и распаде клеточной стенки. Целлюлозолитические
ферменты участвуют в инверсии и распространении патогена, а также играют
важную роль в разрушении клеток и тканей.
24.2.1. Исследования с пектолитическими ферментами эрвинии
Необходимый материал
Раствор пектолитического фермента, бактериальная культура Erwinia
caratovora, клубень картофеля, дистиллированная стерильная вода, эксикаторы
и т. д.
Методика
Клубень картофеля промыть в проточной водопроводной воде и
стерилизовать 0,1-процентным раствором хлористой ртути. Разрежьте клубень
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]