Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
301
В одном методе микрочипы ДНК состоят из физически прикрепленных
фрагментов ДНК, таких как библиотечные клоны или продукты полимеразной
цепной реакции (ПЦР), к твердому субстрату. Основным преимуществом этого
метода является относительно низкая стоимость и существенная гибкость (что
объясняет его широкое внедрение в академической среде), а также отсутствие
предварительного требования первичной информации о последовательности
для печати элемента ДНК. Используя роботизированную матрицу и
капиллярные печатные наконечники, мы можем напечатать более 40000
элементов на предметном стекле микроскопа. В этой системе сканирование
осуществляется двумя лазерами, способными распознавать красители Cy3 и
Cy5.
В другом методе массивы строятся путем синтеза одноцепочечных 25мерных олигонуклеотидов in situ с использованием фотолитографических
методов. Преимущества последнего метода включают более высокую
плотность (>280 000 признаков на массиве 1,28 × 1,28 см) и устранение
необходимости сбора и хранения клонированной ДНК или продуктов ПЦР. Эта
система сканирования микрочипов основана на однократном лазерном базовом
обнаружении пироэртиринового красителя.
31.4. Методика на основе ПЦР
31.4.1. Технология ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это опосредованная праймером
ферментативная амплификация последовательностей ДНК. Амплификацию
выделенного участка из сложной смеси ДНК проводят in vitro с помощью
термостабильного фермента ДНК-полимеразы 1, выделенного из бактерии
Thermus aquaticus.
Это усиление достигается повторяющейся серией циклов, включающих
три шага:
Денатурация: Денатурация дуплекса матричных ДНК при нагревании
при температуре 94°C.
302
Отжиг: Отжиг олигонуклеотидных праймеров к целевым
последовательностям разделенных нитей ДНК при температуре 35°С–65°С.
Синтез или расширение: синтез ДНК с 3'–OH концов каждого праймера
ДНК-полимеразой при 72°C.
При использовании повторяющихся циклов, где продукты расширения
праймеров предыдущего цикла служат новыми шаблонами для следующего
цикла, количество ДНК-мишеней амплифицируется.
Необходимый материал
Термоциклер ПЦР, аппарат и принадлежности для электрофореза
агарозного геля, система документирования геля, микрофужные трубки,
микропипетки, минеральное масло, ПЦР-трубки, наконечники пипеток и
коробки, вихрь, реагенты, ДНТП, праймеры, Taq ДНК-полимераза, химикаты
для электрофореза агарозного геля и буферы. (См. Таблицу 31.3.)
Методика
Добавьте реагенты в 0,2 мл микроцентрифужной пробирки, помещенной
на лед. Реакционную смесь объемом 25 мкл слегка завихряют и закручивают
вниз. Сверху реакционной смеси наносят около 5 мкл минерального масла.
Амплификацию ДНК проводили на термоциклере (Eppendorf, Master Cycler
Gradient, Германия). Условия ПЦР, установленные для амплификации,
приведены в таблице 31.4.
Электрофорез в агарозном геле амплифицированных продуктов ПЦР
Требования
Блок электрофореза (литье геля через гелевые гребни, блок питания),
УФ-трансиллюминатор.
Необходимые решения
Бромид этидия, 10 мг/мл; Отслеживающий краситель, 1% (w/v) BPB +
20% (w/v) Ficoll + 10 мм ЭДТА; агарозу; исходный раствор 10 × TBE, 121 г
Триса (1 М), 51,3 г борной кислоты (830 мМ) и 7,6 г ЭДТА (10 мМ) для
получения конечного объема 1000 мл и регулировки рН 8,0; рабочий раствор 1
× TBE, 10 мл 10 × TBE разбавляют до 100 мл с использованием воды Milli-Q.
303
Методика
Агарозу (1,5 г) добавляют к 100 мл буфера 1 × TBE и расплавляют агарозу
путем нагревания раствора в микроволновой печи. Раствор охлаждают
примерно до 55-60°С и добавляют в него 5 мкл бромида этидия (0,5 мкл/мл).
Агаровый раствор заливают в установку для литья геля после того, как гребень
геля находится в нужном месте. Гелю дают затвердеть при комнатной
температуре. Гель помещают в электрофорезный аппарат таким образом,
чтобы конец с лунками находился на одной линии с катодом. Аппарат заполнен
буфером 1 × TBE для того, чтобы погрузить гель в буфер и предотвратить
попадание пузырьков воздуха при удалении гелевых гребенок. 10 мкл
анализируемого ПЦР-продукта смешивают с 2 мкл отслеживающего красителя
и осторожно загружают в лунки геля. Установка подключается к блоку питания
и электрофорез проводится при напряжении 60 вольт. Амплифицированные
продукты ПЦР наблюдаются под УФ-трансиллюминатером в гелевой системе
документирования (Flour Chem. ™ Alpha Innotech, США) и изображение
захватывается. (См. Таблицу 31.5.)
31.4.2. Идентификация грунтовки/проектирование
Проектирование грунтовки требует учета определенных параметров,
приведенных ниже. Бесплатные дизайнерские праймеры доступны на таких
сайтах, как NCBI gene bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov>руководство>все),
который основан на программном обеспечении Primer3. Мы должны учитывать
целевую область, которая должна быть усилена при разработке праймеров.
31.4.3. Методы ПЦР на основе произвольных/случайных праймеров
31.4.3.1. Случайно Амплифицированные Полиморфные ДНК-маркеры
(RAPD)
Технология RAPD основана на использовании одного случайного
декамерного праймера для ПЦР-амплификации при низких температурах
отжига (32-38°С). Поскольку эта технология не основана на каких-либо
предыдущих знаниях о последовательности, ее универсальное применение
304
делает ее популярной для начальной работы с молекулярными маркерами в
любой новой лаборатории.
Методика
Грунтовки: Любая случайная последовательность декамера без
предварительного знания последовательности может быть использована для
амплификации при условии, что она удовлетворяет существенным критериям
для любого праймера. Рабочие концентрации случайных праймеров (50
пикомолей на мкл) получают с использованием автоклавированной стерильной
дистиллированной воды.
Реакционная смесь для ПЦР: Реакционную смесь для амплификации
готовят в тонкостенных плоских колпачковых ПЦР-пробирках объемом 0,2 мл,
содержащих следующие компоненты, общий объем каждой реакционной
смеси составляет 20 мкл. (См. Таблицу 31.7.)
ПЦР-амплификация: ПЦР-амплификация для анализа RAPD
выполняется в соответствии с Williams et al. (1990) с некоторыми
модификациями. Используемые условия усиления приведены в таблице 31.8.
Разделение амплифицированных продуктов электрофорезом в агарозном
геле: Агарозный гель 1,2% получают с использованием электрофорезной марки
агарозы в объеме электрофорезного буфера (1 × ТАЭ), достаточном для
схватывания геля (300 мл на гель 18 × 30 см). Затем добавляют бромид этидия
в концентрации 0,5 мкл на 10 мл (10 мг/мл) геля. Гель полностью застывает
перед извлечением гребня и загрузкой образца. Пять мкл загрузочного
красителя добавляют к 20 мкл продуктов ПЦР и хорошо перемешивают перед
загрузкой в лунки. Соблюдается осторожность, чтобы предотвратить
смешивание проб между скважинами. Напряжение 1,5 В/см подается в течение
трех часов для разделения фрагментов ПЦР. После прогона гель
просматривается под ультрафиолетовым светом, и картина полосчатости ДНК
наблюдается непосредственно в блоке документации геля (gel doc). Сам узор
305
полос отмечается на цифровом изображении гелей и далее анализируется для
идентификации полиморфных полос.
31.4.3.2 Маркеры Межпростой Последовательности Повторов (ISSR)
Праймеры ISSR предназначены для амплификации области между двумя
областями повторения SSR/микросателлита. Они усиливают такие области,
которые сгруппированы в пределах усиливаемого расстояния в
противоположной ориентации. Праймеры ISSR имеют длину 16-18 оснований,
состоящих из случайных повторов (ди-тетрамер) последовательности с/без
дополнительного случайного добавления одного или двух оснований. Такие
праймеры универсальны, так как их разработка не требует предварительной
информации о последовательности и может быть использована в широком
спектре организмов. Они являются доминантными маркерами, которые
определяют значительный уровень вариации в нескольких локусах в
уникальных областях генома.
Смесь для ПЦР-амплификации: Реакционную смесь для амплификации
готовят в тонкостенных ПЦР-пробирках с плоской крышкой объемом 0,2 мл,
содержащих следующие компоненты. Общий объем каждой реакционной
смеси составляет 20 мкл. Реакционную смесь объемом 20 мкл слегка завихряют
и закручивают вниз. (См. Таблицу 31.9.)
Программа ПЦР: Амплификацию ДНК проводят в термоциклере
(Eppendorf, Master Cycler Gradient, Германия). Условия ПЦР, установленные
для амплификации, приведены в таблице 31.10. Образец помещают в
термоциклер до тех пор, пока он не достигнет 50°С.
Электрофорез в агарозном геле амплифицированных продуктов ПЦР
Необходимый материал
Блок электрофореза (желоб для заливки геля, гелевые гребни, блок
питания); гелевая система визуализации или УФ-трансиллюминация (Gel Logic
1500 Imaging System, США); бромид этидия, 10 мг/мл; 6 × гель-загрузочный
краситель; агарозный буфер, 1 × TAE.
Методика
306
Агарозу (2 г) добавляют к 200 мл 1 × ТАЭ и расплавляют агарозу путем
нагревания раствора в микроволновой печи. Дайте раствору геля остыть
примерно до 55-60°С и добавьте в него 4 мкл бромида этидия (0,5 мкл/мл).
Раствор агарозы заливают в блок литья геля после того, как гребень геля
находится в нужном месте. Гелю дают затвердеть при комнатной температуре.
Гель помещают в электрофорезный аппарат таким образом, чтобы конец с
лунками находился на одной линии с катодом. Аппарат заполнен буфером 1 ×
TAE для того, чтобы погрузить гель в буфер, чтобы предотвратить попадание
пузырьков воздуха при удалении гребня геля.
20 мкл ПЦР-продукта, подлежащего анализу, смешивают с 1/6 объема
загрузочного красителя (M/s. Bangalore Genei Ltd.) и осторожно загружают в
лунки геля. Блок подключается к блоку питания и электрофорез проводится
при напряжении 80 вольт. Источник питания выключается, когда фронт
красителя находится примерно в 2 см от положительного конца (анода).
Линейка ДНК низкого диапазона 100 бп используется в качестве эталона
молекулярного размера для полосы, полученной в результате ПЦР.
Амплифицированный продукт ПЦР наблюдают под УФ-трансиллюминатором
в системе Gel Documentation system (Gel Logic 1500 Imaging System, США) и
захватывают изображение.
Анализ данных
Четко разрешенные ПЦР-амплифицированные полосы оцениваются
вручную в виде двоичной матрицы на наличие (1) и отсутствие (0) в
техническом паспорте. Анализы проводились с использованием
компьютерных пакетов NTSYSpc 2.02 i (Rohlf, 1994).
31.4.4. Методы ПЦР на основе специфичных к последовательности
праймеров
31.4.4.1. Простые повторы последовательностей (SSR) или
Микросателлитные маркеры
Микросателлиты или маркеры простых последовательных повторов
(SSRs) представляют собой тандемно расположенные повторы различной
307
длины повторяющихся мотивов. Простые микросателлиты содержат только
один вид повторов последовательностей (GT)n или (AC)n или (AG)n; в то время
как сложные микросателлиты или составные микросателлиты содержат более
одного типа повторов, например [(GT)2(AC)1(AAG)3]n. Последовательности
ДНК, фланкирующие SSRs, являются уникальными последовательностями и
сохраняются. Эти консервативные фланкирующие последовательности были
использованы для разработки локусспецифичных праймеров, пригодных для
амплификации высокополиморфных SSR-локусов с помощью ПЦР. SSR
широко распространены в геномах растений и животных, которые
демонстрируют высокий уровень генетической изменчивости, основанной на
различиях в количестве тандемно - повторяющихся единиц в локусе.
Микросателлитные маркеры, будучи одиночными локусами, кодоминантные
маркеры имеют преимущества перед доминантными мультилокусными (RFLP
и AFLP) маркерами, поскольку каждый аллель маркеров может быть
обнаружен и данные о частоте различных гомозигот и гетерозигот могут быть
использованы для характеристики селекционной системы.
Этот метод использует праймер для амплификации геномной ДНК,
взятой в качестве шаблона. Профиль амплифицированного фрагмента
генерируется электрофорезом в агарозном геле или электрофорезом в
полиакриламидном геле. Различия в профиле фрагментов различных
генотипов могут быть использованы в качестве генетического маркера для
сортовой или генотипической идентификации, картирования генома и
маркирования генов. Уникальность и ценность микросателлитов обусловлены
их мультиаллельной природой, кодоминантной передачей, простотой
обнаружения методом ПЦР, относительным обилием, обширным охватом
генома и потребностью лишь в небольшом количестве исходной ДНК.
Необходимый материал
Оборудование и другие материалы: термоциклер ПЦР; аппарат
электрофореза агарозного геля и принадлежности к нему; система
308
документирования геля; микрофуговые трубки; микропипетки; минеральное
масло; ПЦР-трубки; наконечники и коробки пипеток; вихрь.
Реагенты: dNTPs =; микросателлитные праймеры (прямые и обратные);
Taq ДНК-полимераза; химические вещества для электрофореза в агарозном
геле и буферы. (См. Таблицу 31.11.)
Методика
Добавьте реагенты в 0,2 мл микроцентрифужной трубки, помещенной на
лед. Реакционную смесь объемом 20 мкл слегка завихряют и закручивают вниз.
Сверху реакционной смеси наносят около 5 мкл минерального масла.
Амплификацию ДНК проводят на термоциклере (Eppendorf, Master Cycler
Gradient, Германия). Условия ПЦР, установленные для амплификации,
приведены в таблице 31.12.
Электрофорез в агарозном геле амплифицированных продуктов ПЦР
Методика
Агарозу (2,5 г) добавляют к 100 мл буфера 1 × TBE и расплавляют агарозу
путем нагревания раствора в микроволновой печи. (Поскольку большинство
фрагментов, полученных после ПЦР, имеют размер менее 5 кб, для достижения
лучшего разрешения фрагментов используется высокопроцентный гель).
Раствор охлаждают примерно до 55-60°С и добавляют в него бромид этидия (1
мкл/10 мл). Агаровый раствор заливают в блок заливки геля после того, как
гребень геля находится в нужном месте. Гелю дают затвердеть при комнатной
температуре. Гель помещают в электрофорезный аппарат таким образом,
чтобы конец с лунками находился на одной линии с катодом. Аппарат
заполняется буфером 1 × TBE для того, чтобы погрузить гель в буфер и
предотвратить попадание пузырьков воздуха при удалении гелевых гребенок.
20 мкл анализируемого ПЦР - продукта смешивают с 2 мкл отслеживающего
красителя и осторожно загружают в лунки геля. Установка подключается к
блоку питания и электрофорез проводится при напряжении 60 вольт. Источник
питания был выключен, когда фронт красителя находился примерно в 2 см от
положительного конца (анода). Амплифицированные продукты ПЦР
309
наблюдаются под УФ-трансиллюминатором в гелевой системе
документирования и захватывают изображение.
31.4.4.2. Однонуклеотидный полиморфизм (SNP)
SNP–это различия в одной паре оснований в ДНК, обусловленные
точечными мутациями (заменами или вставками/делециями). С учетом
последних достижений в области технологий секвенирования генома и
доступных последовательностей в общественном достоянии они, скорее всего,
станут идеальным маркером для популяционного анализа в ближайшем
будущем. Они представляют собой наиболее распространенную вариацию и
обеспечивают общегеномное представление о популяции. Однако разработка
SNP занимает много времени и требует технически квалифицированной
рабочей силы.
31.4.5. Модифицированные методы ПЦР
31.4.5.1. Мультиплексная ПЦР
Мультиплексно-тандемная ПЦР (МТ-ПЦР) - это технология,
разработанная для мультиплексного профилирования экспрессии генов и
быстрой диагностики важных патогенов (Stanley and Szewczuk, 2005). Она
включает в себя параллельную амплификацию различных целевых фрагментов
ПЦР в однотрубных реакциях для множественного обнаружения патогена. Он
состоит из двух раундов усиления. На первом этапе проводится
мультиплексная ПЦР в течение 10-15 циклов, чтобы обеспечить обогащение
ДНК-мишени без создания конкуренции между ампликонами (Lau et al., 2008).
Этот продукт разбавляется и используется в качестве шаблона для второй
амплификации, которая состоит из нескольких индивидуальных
количественных ПЦР-реакций с праймерами, вложенными в те, которые
используются в мультиплексной ПЦР. Одновременно можно
мультиплексировать и проводить до 72 различных ПЦР-реакций.
Флуоресценция измеряется с помощью технологии SYBR green в конце
каждого цикла расширения, а анализ кривой расплава обеспечивает
видоспецифическую или геноспецифическую идентификацию. Включение
310
двух наборов видоспецифических праймеров для каждой мишени
обеспечивает правильную амплификацию и детекцию, что позволяет избежать
затрат на ДНК-зонды. Обнаружение SYBR green также увеличивает
мультиплексирующую и количественную емкость систем ПЦР в реальном
времени, которые обычно ограничены наличием флуоресцентных каналов и
необходимостью оптимизации каждой отдельной мультиплексной ПЦР.
Хотя мультиплексная ПЦР выгодна с точки зрения времени и стоимости,
но трудности возникают, когда в одной пробирке для ПЦР-реакции
используется более одной пары праймеров. Разработка эффективной
мультиплексной ПЦР требует трудоемкого стратегического и математического
моделирования конструкции праймеров, соотношений праймеров, длин
фрагментов, концентраций нуклеотидов, оптимальных солевых и буферных
условий, а также химических адъювантов. Необходимо изменить условия
реакции, такие как условия отжига, количество MgCl2 и время расширения
полимеразы.
31.4.5.2. Вложенная ПЦР
Он включает в себя два раунда ПЦР-амплификации, второй из которых
выполняется с использованием праймеров, которые гибридизуются внутри
фрагмента, амплифицированного во время первого раунда ПЦР. Этот подход
дает преимущество в повышении как чувствительности, так и специфичности
ПЦР. В Интернете доступно большое количество специфичных для патогена
праймеров. Специфичность ПЦР зависит от уникальности
последовательностей, выбранных для праймеров и зондов. Улучшения в
технике секвенирования делают выбор надежных праймеров рутиной.
31.4.5.3. ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени позволяет точно и быстро обнаруживать
патогены растений (Schaad and Fredreick, 2002). ПЦР в реальном времени-это
основанный на кинетике количественный метод ПЦР, при котором количество
вновь синтезированной ДНК измеряется после каждого цикла на протяжении
всего процесса ПЦР-амплификации. На практике видеокамера обнаруживает
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]