Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
351
стерильную тарелку Петри и дайте среде затвердеть в наклонном положении,
поместив карандаш под один край.
После затвердевания агаровой среды снимите карандаш с пластины и
поместите его в горизонтальное положение.
Капните 0,1 мл раствора стрептомицина (100 мкг/мл) во вторую
пробирку с расплавленной питательной агаровой средой, поверните пробирку
между ладонями и вылейте содержимое, чтобы покрыть слой градиентного
агара и дать ему затвердеть на ровном столе.
Обозначьте область низкой и высокой концентрации на нижней части
пластины.
Первая Прививка
Пипеткой наносят 0,2 мл суспензии исследуемой бактерии на
градиентную пластину через 24 часа после ее приготовления. С помощью
смоченного в спирте, обожженного и охлажденного изогнутого стеклянного
стержня равномерно распределите инокуляты по поверхности агара, вращая
пластину. Инкубируйте привитую пластину в перевернутом положении при
температуре 28±2 °C в течение 48-72 часов.
Понаблюдайте на пластинке за появлением колоний тестируемых
бактерий в области низкой концентрации стрептомицина (LSC) и высокой
концентрации стрептомицина (HSC), подсчитайте их и запишите результаты.
Результаты
Колонии тестируемых бактерий, которые появляются в области высокой
концентрации стрептомицина, будут мутантами, устойчивыми к
стрептомицину. Выберите и отметьте изолированную колонию тестируемой
бактерии в области HSC.
Вторая Прививка
Выберите выбранную колонию с помощью стерильной прививочной
петли и нанесите полосу на вторую градиентную пластину в направлении
участка с высокой концентрацией. Повторите этот шаг с двумя или тремя
колониями мутантов, устойчивых к стрептомицину, из области HSC.
352
Инкубируйте привитые пластины в перевернутом положении при температуре
28±2 °C в течение 24-72 часов. Исследуйте каждую пластинку на наличие
линии роста от полосатых колоний в область высокой концентрации
стрептомицина.
Результаты
Развитие колоний тестируемых бактерий в области HSC указывает на
успешную изоляцию мутантов, устойчивых к стрептомицину.
Меры предосторожности
Всегда помечайте нижнюю часть пластины, чтобы показать области с
низкой и высокой концентрацией стрептомицина.
Градиентная пластина должна быть подготовлена по крайней мере за 24
часа до прививки, чтобы обеспечить возможность установления градиента
антибиотика в пластине. Всегда выращивайте организм за ночь в густом
бульоне. Не трогайте пластину с питательным агаром, если ее держать в
наклонном положении, пока не произойдет полное затвердевание.
34.2. Выделение авирулентных мутантов (мутация по характеру
патогенности)
Необходимый материал
Вирулентная культура бактериального патогена, питательная агаровая
среда, скосы питательного агара, антибиотик сульфата стрептомицина,
растение-хозяин бактериального патогена.
Методика 1
Субкультуру вирулентной бактериальной культуры на питательном
агаре наклоняют и инкубируют при 28 ±2 °C в течение 48 часов для ее роста.
Через 8-10 дней подкормите бактерию сверху пробирки и дайте ей вырасти, как
указано выше. Повторите один и тот же процесс субкультуры в течение 8-9
поколений. Возьмите рост 9-го поколения и используйте его для теста на
вирулентность растения-хозяина с помощью шприца для подкожных
инъекций.
353
Понаблюдайте за реакцией, развившейся у изолята на растении-хозяине,
и сравните ее с восприимчивой реакцией, развившейся у исходных изолятов.
Отсутствие реакции на заболевание указывает на превращение вирулентного
изолята в авирулентный изолят из-за частого субкультурирования.
Методика 2
Нанесите вирулентный бактериальный изолят на 50 частей на миллион,
содержащие стрептомицин, пластины и инкубируйте в течение 5 дней.
Выберите колонии, созданные на этой пластинке, субкультуру и проверьте на
вирулентность. Нанесите 50 частей на миллион стрептомицинрезистентный
изолят на 100 частей на миллион стрептомицинсодержащую пластину и
инкубируйте в течение 5 дней. Выберите колонии, созданные на этой
пластинке, субкультуру и проверьте на вирулентность. Та же процедура
должна выполняться для более высокой концентрации стрептомицина.
Понаблюдайте за восприимчивостью или отсутствием реакции,
развившейся у устойчивого к стрептомицину изолята на растении-хозяине, и
сравните с восприимчивой реакцией, развившейся у исходного изолята.
Отсутствие реакции на заболевание указывает на превращение вирулентного
изолята в авирулентный из-за устойчивости к антибиотикам или мутанта,
устойчивого к антибиотикам.
Поддерживайте авирулентный изолят на среде, содержащей стрептомицин,
соответствующей концентрации.
Методика 3
Проникните в 48-часовой рост вирулентной тест-бактерии в cv
устойчивости растения-хозяина. Изолируйте бактерию из инфильтрированных
участков на 2-й день и выращивайте их на питательной агаровой среде. Снова
инфильтрируйте эту культуру на cv устойчивости растения-хозяина и
изолируйте от инфильтрированных участков на 2-й день инфильтрации и
выращивайте культуру на питательной агаровой среде. Следуйте тому же
процессу в течение 6-7 поколений проникновения и изоляции.
354
После 7 поколений изоляций из резистентных cvs, подготовьте
бактериальную культуру и привейте восприимчивым хозяевам cvs бактерии.
Наблюдайте за развитием/отсутствием симптомов заболевания на
восприимчивом резюме хозяина. Отсутствие развития симптомов заболевания
указывает на развитие авирулентного мутанта из вирулентной культуры через
резистентный cvs хозяина.
34.3. Выделение мутанта-альбиноса (мутация для пигментации)
Необходимый материал
Тест-культуры ксантомонад, питательная агаровая среда, различный
фенол. Известно, что фенолы вызывают альбинизм у ксантомонад (Боркар и
Верма, 1984а).
Методика
Приготовьте концентрацию 0,007, 0,005, 0,003 и 0,001 частей на миллион
фенольных веществ, в частности пирогаллола, катехола, резорцина, фенола и
гидроксихинона, в пластинах с питательным агаром. Инокулируйте
соответствующую пластинку тест-культурой бактерий Xanthomonas и
инкубируйте до 120 часов при 28 ±2 °C в инкубаторе для появления колоний
альбиносов.
Наблюдайте за развитием колоний альбиносов для соответствующего
фенола, его концентрацией и периодом, необходимым для развития колоний
альбиносов.
34.4. Дифференциация вирулентного и авирулентного мутанта
Вирулентные и авирулентные типы колоний Pseudomonas solanacearum и
некоторых других фитопатогенных бактерий, таких как Erwinia carotovora,
Pseudomonas phaseolicola, Corynebacterium insidosum и т. Д., Можно различить
на агаровой среде с хлоридом тетразолия.
Протокол
Приготовьте базальную среду, содержащую пептон, 10 г; казаминовую
кислоту, 1,0 г; агар–агар, 20 г; дистиллированную воду, 1000 мл. Стерилизуйте
среду в колбах в количестве 200 мл. Охладите его до 45 °C и в каждую колбу
355
добавьте по одному мл стерильного 1-процентного раствора 2,3,5 трифенола
тетразолия хлорида (TZC). Это даст 0,005-процентную концентрацию TZC в
агаровой среде. Раствор TZC следует стерилизовать фильтрованием или
автоклавированием в течение 8 минут и хранить в темном месте.
Разлейте среду по тарелкам. После того, как агар затвердеет, нанесите
разбавленную суспензию бактериальной культуры. Инкубируйте в течение 2448 часов при оптимальной температуре роста и исследуйте колонии.
Наблюдение
У R. solanacearum в пределах вирулентных колоний более вирулентный
можно отличить от менее вирулентного по количеству покраснения,
присутствующего в центре. Более вирулентный имеет меньшее покраснение, а
менее вирулентный имеет большее покраснение.
356
35. ПЕРЕНОС ГЕНЕТИЧЕСКОГО ФАКТОРА В
ПАТОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ РАСТЕНИЙ
Генетическая изменчивость создается у всех живых существ путем
переноса и рекомбинации генетического материала двух различных
генетических типов, будь то люди, животные, растения или микроорганизмы.
Бактерии - это одноклеточный организм, который размножается делением
посредством бинарного деления и переносит свой собственный генетический
материал из одной клетки в другую во время бинарного деления, чтобы
обладать тем же генетическим составом и характеристиками. Создание
изменчивости - это явление в природе, и для создания этой изменчивости в
одноклеточном организме, таком как бактерии, известны по меньшей мере три
способа передачи генетического материала от неродственных или
близкородственных видов.
35.1. Передача генетического материала путем трансформации
Перенос генетического материала путем трансформации был
продемонстрирован Боркаром и Вермой (1991b) в изолятах Xanthomonas
campestris pv. malvacearum.
Трансформацию характера патогенности среди штаммов Xanthomonas
campestris malvacearum в растениях изучали с использованием ДНК
вирулентной расы Xanthomonas campestris malvacearum-32 (чувствительной к
стрептомицину) и жизнеспособной культуры с экспоненциальной фазой
авирулентной расы Xanthomonas campestris malvacearum-32 (мутант,
устойчивый к стрептомицину) и авирулентной расы Xanthomonas campestris
malvacearum-1 (полученной путем повторного подкультуривания).
Необходимый материал
ДНК вирулентной расы, бактериальная культура авирулентной расы, cv
восприимчивого хозяина.
Методика
357
Выделение ДНК: ДНК штамма Xanthomonas campestris malvacearum
выделена, как описано ранее (Боркар и Верма, 1988). Суспендируйте
экспоненциальную фазу культуры вирулентного штамма Xanthomonas
campestris malvacearum в 5 мл трис-буфера (50 ммоль/л, рН 8,0) и
отрегулируйте до поглощения 1,0 при 620 нм. Добавьте один мл раствора
лизоцима (концентрация 5 г/л) и одну каплю CHCl3 в бактериальную
суспензию и дайте постоять 1 час. Добавьте 0,2 мл 10-процентного
додецилсульфата натрия и держите пробирки на водяной бане при 40 °C в
течение 10 минут. Добавьте 5 мл раствора NaCl в эту суспензию, чтобы довести
конечную концентрацию NaCl до 1 моль/л. Храните суспензию при
температуре 4 °C в течение ночи и центрифугируйте (250 Гц, 15 минут).
Декантируйте супернатант (содержащий плазмидную ДНК) и растворите
остатки (содержащие хромосомную ДНК) в 5 мл стерилизованной воды.
Экранируйте супернатант и остаток в ультрафиолетовом диапазоне, чтобы
определить наличие ДНК и наблюдать абсолютный пик для ДНК. Храните
ДНК при температуре 4 °C для экспериментов по трансформации.
Трансформация характера патогенности из вирулентного штамма в
авирулентный: Эксперимент должен проводиться с общей ДНК, плазмидной
ДНК и хромосомной ДНК вирулентного штамма. В качестве среды для
трансформации используется сорт хлопка Стоунвилл 2BS9 (проявляющий
восприимчивость к вирулентной, но гиперчувствительность к авирулентной
расе-1 и отсутствие реакции на авирулентную расу-32).
Инфильтрируйте культуру экспоненциальной фазы (3×106 КОЕ на
инфильтрацию на пятно) авирулентной расы-1 и авирулентной расы-32
отдельно, смешанной с 1 мл общей, хромосомной и плазмидной ДНК
вирулентной расы-32 соответственно в тканях листьев хлопка. Поддерживайте
надлежащий контроль только с помощью общей, хромосомной и плазмидной
ДНК, а также авирулентной расы-1 и авирулентной расы-32 на одних и тех же
тканях листьев. Поддерживайте инфильтрированные растения при
358
температуре 28 °C в тепличных условиях, чтобы наблюдать за инициированием
чувствительной реакции впитывания воды и образованием трансформантов.
Выделение и определение трансформантов: Используйте
инфильтрированные участки с общей ДНК вирулентного штамма и
жизнеспособными клетками авирулентных штаммов для выделения
трансформантов. Изолировать возможные трансформанты
(инфильтрированные участки асептически мацерировали стерилизованной
водой, и последовательное разведение наносили на питательную среду
сахарозо-агар (в г): Пептон, 5; экстракт говядины, 3; сахароза, 5; агар, 20; и
дистиллированная вода, 1 л; рН 7,0) после 12 часов инфильтрации (ДНК
вирулентного штамма и бактериальной культуры авирулентного штамма) с
интервалом 6 часов до 2 дней на питательной агаровой среде.
Подсчитайте колонии и субкультурные отдельные колонии и проникните
в листья хлопка, чтобы проверить их вирулентность (способность вызывать
реакцию впитывания воды). Авирулентная бактерия, которая приобретает ДНК
вирулентного штамма путем трансформации, становится вирулентной.
Определите количество трансформантов, образовавшихся в результате
рекомбинации.
35.2. Передача генетического материала путем конъюгации
Джошуа Ледерберг и Эдвард Л. Татум в 1946 году впервые
продемонстрировали конъюгацию бактерий с использованием тройных
ауксотрофов E. coli и разделили Нобелевскую премию в 1958 году за свою
работу по генетике бактерий. Бактериальная конъюгация - способ полового
спаривания, при котором плазмида или другой генетический материал
переносится донором (мужчиной) в клетку-реципиент (женщину) через
специализированный придаток. Воллман и др. в 1952 году
продемонстрировали, что этот перенос генов во время конъюгации был
полярным, то есть существовали определенные донорские (F+) и
реципиентные (F−) штаммы, и перенос генов был невзаимным. Эта
дифференциация или существование различных типов спаривания у бактерий
359
была установлена Франсуа Жакобом и Эли Л. Воллманом и определяется
наличием плазмиды (фертильности или фактора F) в клетке-доноре, которая
позволяет ей синтезировать половую пилюлю или пилюлю-реципиента.
Плазмида представляет собой внехромосомную замкнутую кольцевую
двухцепочечную ДНК, которая меньше и реплицируется независимо от
клеточной хромосомы. Эти клетки, имеющие плазмиды, называются F+.
Клетка-реципиент представляет собой родственный вид или род, который
имеет сайт распознавания на своей поверхности, но не имеет плазмиды и
обозначается F. Бактериальная конъюгация демонстрирует три модели
генетического переноса: (1) перенос фактора F+, (2) перенос Hfr и (3)
конъюгация или соблазнение F0. При передаче фактора F+ во время
конъюгации передается только копия фактора F (т. е. плазмида или эписома), а
донорские гены обычно не передаются. При Hfr (высокочастотной)
рекомбинации фактор F включается в бактериальную хромосому, происходит
передача бактериальных генов реципиенту, и клетки обозначаются как
высокочастотные рекомбинанты. Соблазнение, специализированная форма
конъюгации, при которой фактор F во время его отделения от хромосомы Hfr
забирает некоторые бактериальные гены, чтобы стать плазмидой F0, которая
легко переносит эти гены другим бактериям во время конъюгации.
Демонстрация конъюгации у бактерий может быть выполнена в
лаборатории с использованием двух ауксотрофных штаммов E.coli (один
штамм, способный синтезировать метионин, но не треонин, то есть thr−met+, и
другой штамм, способный синтезировать треонин, но не метионин, то есть
thr+met−, и оба неспособны расти в минимальной среде), которые смешивают
в питательном бульоне и инкубируют в течение нескольких часов, а затем
помещают на минимальную среду. Если колонии появятся на минимальной
агаровой среде после инкубации, то это будет связано с генетической
рекомбинацией.
Необходимый материал
360
Двенадцатичасовой питательный бульон ауксотрофный штамм E.coli
(thr−met+) мужской (M)-штамм 1; 12-часовой питательный бульон
ауксотрофный штамм E.coli (thr+met−) женский (F)-штамм 2; пластины из
триптиказного соевого агара (TSA) (полная среда), минимальная агаровая
пластина, стерильные пипетки по 1 мл, стерильная пробирка 13×100 мм.
Стакан с 70-процентным этиловым спиртом, изогнутый стеклянный стержень,
механическое устройство для пипетки, стеклянный маркерный карандаш и так
далее.
Методика
С помощью отдельных стерильных пипеток по 1 мл асептически
переносят по 1 мл из каждой культуры (т. е. ауксотрофных штаммов I и II) в
стерильную пробирку размером 13×100 мм (маркированную пробирку для
конъюгации). Смешайте две культуры, осторожно вращая пробирку между
ладонями. Инкубируйте смешанную культуру при температуре 28 °C в течение
30 минут. После инкубации энергично перемешайте смешанную культуру,
чтобы прекратить генетический перенос. С помощью стерильной пипетки
объемом 1 мл асептически перенесите 0,1 мл из конъюгационной трубки в
соответствующим образом маркированную минимальную агаровую
пластинку. Используя стерильную стеклянную палочку, распределите
прививки по всей пластине.
Подготовьте контрольные пластины, чтобы установить, что два
ауксотрофных штамма E.coli хорошо росли на полной среде (TSA), но не на
минимальном агаре (MA), используя метод распространения пластины, как
описано ниже: Асептически добавьте по 0,1 мл каждого штамма E.coli (т. Е.
самки и самца) на его соответствующим образом маркированные агаровые
пластины: TSA-Самец, TSA-Самка, MA-Самец и MA-Самка. С помощью
стерилизованного изогнутого стеклянного стержня распределите среду по всей
поверхности агаровой пластины. Инкубируйте все привитые пластины (2
пластины TSA, 3 пластины MA; т. е. контрольную и экспериментальную) в
перевернутом положении в течение 48 часов при 28°C. Обратите внимание на
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]