Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
231
и раздавите их пестиком и ступкой в дистиллированной стерильной воде.
Отфильтруйте суспензию через стерильную фильтровальную бумагу Whatman
№ 24 в стерильной пробирке, чтобы удалить сокрушение насекомых. Пластину
0,2 мл суспензии на питательной агаровой пластине инкубируют при
температуре 27 ± 2°С.
Соберите насекомое с больного поля и соберите его экскременты.
Храните экскременты в лабораторных условиях в течение длительного периода
времени. Растворите экскременты в дистиллированной стерильной воде с
различными интервалами и перемешайте на магнитной мешалке. Фильтруйте
суспензию через стерильную фильтровальную бумагу Whatman № 24 в
стерильной пробирке. Пластину 0,2 мл суспензии помещают на питательную
агаровую пластину и инкубируют при температуре 27 ± 2°С.
Наблюдайте за бактериальными колониями в каждом эксперименте,
отмечайте их морфологические признаки и сравнивайте с исходной культурой
бактериального растительного патогена, проявляющего симптомы
заболевания.
На основании колоний, появляющихся в индивидуальном эксперименте,
определяют внешнюю/внутреннюю передачу бактериального возбудителя.
Если бактерии выживают через различные линьки насекомого или на/в
насекомом, в их экскрементах в течение различного периода, то
предполагается, что увековечивание бактерий происходит в насекомом.
28.5. О реализации
Сельскохозяйственные орудия и секаторы действуют как средства
передачи патогенных бактерий растений. В процессе культивирования или
обрезки они загрязняются бактериями, которые могут выжить или
увековечиться.
Необходимый материал
Сельскохозяйственные орудия, секаторы, дистиллированная стерильная
вода, питательные агаровые пластины.
232
Методика
Протрите сельскохозяйственное орудие или секатор, используемый в
зараженном бактериями растении сада или поля, влажным стерилизованным
хлопком. Суспендируйте вату в достаточном количестве стерильной
дистиллированной воды и дайте постоять 10 минут. Пластину 0,2 мл этой
суспензии помещают на питательную агаровую пластину, намазывают
стеклянной палочкой и инкубируют пластину в инкубаторе при температуре 27
± 2°С.
Понаблюдайте за бактериальными колониями в пластинке, отметьте их
морфологические характеристики и сравните с исходной культурой
бактериального растительного возбудителя, проявляющего симптомы
заболевания.
Для определения увековечивания бактерий на орудии одна и та же
процедура или эксперимент должны проводиться с разным интервалом (в днях)
и определяться увековечивание. Период времени, в течение которого были
обнаружены последние бактериальные колонии из мазка орудия,
рассматривается как период увековечения бактериального патогена на орудии.
233
29. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ
При взаимодействии растения с сортом–бактериальным патогеном, в
благоприятных для развития болезни условиях окружающей среды, если
растение-хозяин cv не проявляет никакой реакции или гиперчувствительной
реакции без индукции симптомов заболевания, этот тип реакции известен как
устойчивость растения к данному патогену. Растение cv может иметь как
вертикальное, так и горизонтальное сопротивление. Сорт растения может
проявлять устойчивость к одной расе данного патогена (известную как
вертикальная устойчивость) и может быть восприимчив к другим расам того
же патогена. Известно, что сорт растения, проявляющий устойчивость к
нескольким расам или ко всем известным расам данного возбудителя, обладает
горизонтальной устойчивостью.
29.1. Определение вертикального сопротивления
Необходимый материал
Имеется зародышевая плазма культуры, известная бактериальная раса
возбудителя, инфильтрационный шприц, вода, метки и так далее.
Методика
Выращивайте доступную зародышевую плазму культуры в
полихаусе/теплице/поле при правильном управлении. Когда растению
культуры исполнится 30-45 дней, пометьте листья отдельной зародышевой
плазмой растения. Приготовьте бактериальную суспензию (0,1 OD) известной
расы и инфильтрируйте ее в дорсальную сторону меченых листьев.
Инфильтрация должна проводиться при наличии надлежащих условий
окружающей среды в поле для развития болезни. Если эксперимент проводится
в теплице/теплице, поддерживайте влажность (выше 87 процентов) и
температуру (27 ± 2°C) для правильного развития болезни. Наблюдайте за
реакцией болезни на замачивание в воде или резистентной
гиперчувствительной реакцией на второй, четвертый и восьмой день прививки.
234
Примечание: При болезнях увядания используйте метод погружения
корней или метод орошения почвы, как описано ранее.
Развитие либо гиперчувствительной реакции потемнения без
дальнейшего распространения, либо отсутствие реакции указывают на наличие
вертикальной резистентности у сорта культуры к специфической расе/изоляту
бактерий.
29.2. Определение горизонтального сопротивления
Необходимый материал
Доступная зародышевая плазма культуры, доступные расы
бактериального возбудителя, инфильтрационный шприц, вода, бирка и так
далее.
Методика
Выращивайте доступную зародышевую плазму культуры в
полихаусе/теплице/поле при правильном управлении. Когда культурному
растению исполнится 30-45 дней, пометьте листья отдельного растения
зародышевой плазмы номером бактериальной расы, подлежащей инокуляции.
Приготовьте бактериальную суспензию (0,1 OD) индивидуальной расы
асептически. Следует позаботиться о том, чтобы бактериальные клетки другой
расы не смешивались друг с другом. Инфильтрируйте приостановку
индивидуальной гонки в помеченный отпуск для того же самого. Таким
образом, все расы должны быть внедрены в свои собственные помеченные
листья. Инфильтрация должна проводиться при наличии надлежащих условий
окружающей среды в поле для развития болезни. Если эксперимент проводится
в теплице/теплице, поддерживайте влажность (выше 87 процентов) и
температуру (27 ± 2°C) для правильного развития болезни. Наблюдайте за
реакцией болезни замачивания воды или резистентной гиперчувствительной
реакцией на второй, четвертый и восьмой день прививки.
Примечание: При болезнях увядания используйте метод погружения
корней или метод орошения почвы, как описано ранее.
235
Запишите гиперчувствительную реакцию или реакцию замачивания
воды отдельных рас на одном и том же растении. Если растение проявляет
сопротивление движению более чем одной или нескольких рас, то
предполагается, что оно обладает горизонтальным сопротивлением против
описанных рас.
29.3. Определение горизонтального сопротивления с помощью одиночного
кольца
Концепция использования одной расы для определения горизонтальной
резистентности основана на использовании более вирулентной расы,
способной атаковать большинство устойчивых генов в CV растения. Эта
концепция была дана и продемонстрирована Боркаром (1990) для
взаимодействия хлопок–Хам, определяющего горизонтальное сопротивление.
Необходимый материал
В наличии зародышевая плазма урожая, наиболее вирулентная раса (раса
32 Хам для хлопка), инфильтрационный шприц, вода, бирки.
Методика
Выращивайте доступную зародышевую плазму культуры в
полихаусе/теплице/поле при правильном управлении. Когда растению
исполнится 30-45 дней, пометьте листья индивидуальной зародышевой
плазмой растения. Приготовьте бактериальную суспензию (0,1 OD) наиболее
вирулентной расы (известно, что она атакует более одного резистентного гена)
и инфильтрируйте ее в дорсальную сторону меченых листьев. Инфильтрация
должна проводиться при наличии надлежащих условий окружающей среды в
области развития заболевания. Если эксперимент проводится в
теплице/теплице, поддерживайте влажность (выше 87 процентов) и
температуру (27 ± 2°C) для правильного развития болезни. Наблюдайте за
реакцией болезни замачивания воды или резистентной гиперчувствительной
реакцией на второй, четвертый и восьмой день прививки.
Примечание: При болезни увядания используйте метод погружения
корней или метод орошения почвы, как описано ранее.
236
Развитие гиперчувствительной реакции потемнения без дальнейшего
распространения или отсутствие реакции указывают на наличие
горизонтальной резистентности у данного cv/сорта к бактериальному патогену.
237
30. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ
ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО МЕТОДА
Вещества, которые в настоящее время идентифицированы как
модифицированные глобулины, образуются не только в результате инфекции,
но и в результате введения некоторых опасных веществ с высокой
молекулярной массой, таких как токсины бактерий, животных, растений или
мертвых бактерий.
Помимо первоначального интереса к резистентности (иммунитету) к
болезням, другие исследования в области иммунологии обнаружили, что
иммунитет, вызванный бактериями и токсинами, является лишь частью более
общего принципа: тот же механизм срабатывает, когда животные прививаются
материалами, такими как клетки или белки, полученные из чужеродных видов.
В этом случае в крови появляются антитела, вызывающие агломерацию,
разрушение клеток или осаждение этих белков.
Все иммунные антитела специфичны. Это буквально означает, что они
реагируют только на один антиген (тот, который используется для
иммунизации). Антигенами могут быть белки, клетки из крови другого вида,
бактерии или вирусы.
Современные биологические науки разработали эффективные и точные
биохимические и иммунологические методы диагностики различных важных
заболеваний, заменив тем самым более традиционные методы.
Иммунодиагностические методы используются при идентификации
растительных патогенных бактерий в лабораторных или непосредственно
полевых условиях для идентификации возбудителя. Они обычно используются
для идентификации патогенных бактерий растений из импортированного
семенного материала или питомникового растительного материала. Они
специфичны для идентификации патогена растений, где используются
специализированные антитела или антисыворотка. Эта глава посвящена общей
238
терминологии в иммунологии; приготовлению антигена и антисыворотки; и
методам, используемым для идентификации патогенных бактерий растений.
Общая терминология и значение
Лейкоциты-Это белые кровяные тельца иммунной системы, которые
участвуют в защите организма от инфекционных заболеваний и инородных
захватчиков. Лейкоциты встречаются по всему организму, в том числе в крови
и лимфатической системе. Существуют различные типы лейкоцитов, среди
которых наиболее важными являются
Моноциты: Они являются самым крупным типом лейкоцитов, обычно
15-18 мкм, и могут дифференцироваться в макрофаги или дендритные клетки.
Являясь частью врожденной иммунной системы позвоночных, моноциты
также влияют на процесс адаптивного иммунитета. Моноциты составляют от 2
до 10 процентов всех лейкоцитов в организме человека и выполняют
множественную роль в иммунной системе.
Лимфоциты: Это один из подтипов белых кровяных телец в иммунной
системе позвоночных. Лимфоциты включают естественные киллерные клетки
(NK-клетки, которые функционируют в клеточном опосредованном
цитотоксическом врожденном иммунитете), Т-клетки (для клеточного
опосредованного цитотоксического адаптивного иммунитета) и В-клетки (для
гуморального, управляемого антителами адоптивного иммунитета). Они
являются основными типами клеток, обнаруживаемых в лимфе, и поэтому
известны как лимфоциты. Они составляют 8-9 мкм и составляют 30-35% всех
лейкоцитов.
Эозинофилы: Также известные как эозинофилы или ацидофилы, они
представляют собой разновидность белых кровяных телец и один из
компонентов иммунной системы, ответственных за борьбу с многоклеточными
паразитами и некоторыми инфекциями у позвоночных. Они также
контролируют механизм, связанный с аллергией и астмой. Они кислотолюбивы
и окрашиваются эозиновым красителем. У нормального человека они
составляют около 1-6% лейкоцитов и имеют размер около 12-17 мкм.
239
Антигены: Вещества, способные индуцировать иммунологический ответ
(гуморальные, клеточные или смешанные Т-и В-клетки), при введении в
организм животных называются антигенами или иммуногенами. Большинство
антигенов являются макромолекулярными белками, но также могут быть
иммуногенами, полисахаридами, синтетическими полипептидами, а также
другими синтетическими полимерами.
Иммуногенные молекулы имеют следующие характеристики: Молекулы
должны быть чужеродными для хозяина. Молекулы с молекулярной массой
более 10 000 являются слабыми иммуногенами; белки с молекулярной массой
более 1 000 000 являются более сильными иммуногенами. Молекула должна
обладать определенной степенью сложности, чтобы быть антигенной.
Иммуногенность возрастает с усложнением структуры. Кроме того,
ароматические аминокислоты вносят больший вклад в иммуногенность, чем
остатки неароматических аминокислот. Способность реагировать на антиген
зависит от вида животного и даже от его генетической конституции. Выработка
иммуноглобулина требует связывания антигена с поверхностью лимфоцита.
Комбинированные участки на поверхности лимфоцита, состоящие из молекул,
похожих на антитела, называются антигенными рецепторами. Только
ограниченные части антигенных молекул связаны с участками комбинации
антител. Эти области называются антигенными детерминантами, и они
определяют реакции антиген–антитело. Антигенная детерминанта может
содержать только 6-7 аминокислот от общего количества белка. Другими
словами, вирус, например, индуцирует выработку смеси антител, которые
специфически реагируют на различные антигенные детерминанты,
присутствующие в частице. Таким образом, антисыворотку, содержащую
смесь антител, можно определить как поликлональную антисыворотку.
Количество антигенных детерминант в одной молекуле изменяется в
зависимости от размера молекулы и ее сложности.
Гаптен: Это небольшая, химически определенная молекула, которая не
может индуцировать выработку специфических антител против себя. Однако,
240
когда он ковалентно связан с более крупной молекулой, он может действовать
как антигенный детерминант и индуцировать синтез антител.
Адъювант: Адъюванты-это химические вещества, используемые для
усиления иммунологического ответа. Они не только стимулируют образование
антител, но и локализуют их в месте инъекции в виде отложений, из которых
они медленно высвобождаются в период синтеза антител либо путем
адсорбции на твердой частице, либо путем их включения в маслянистую
эмульсию. Наиболее часто используемые адъюванты-фосфат кальция,
неорганические гели, гидроксид алюминия, бентонит, ментолированный
сывороточный альбумин и неполный адъювант Фрейнда. Это наиболее часто
используемый адъювант с вирусными антигенами и состоит из 9 частей
минерального масла (ланолина) и 1 части моющего средства; он позволяет
образовывать стабильную эмульсию. Если смесь также содержит мертвые
клетки Mycobacterium sp., ее называют полным адъювантом Фрейнда.
Антитела-это иммуноглобулин, вырабатываемый организмом в ответ на
вторжение чужеродных соединений, таких как белки, гликозиды или полимеры
нуклеиновых кислот. Молекула антитела нековалентно связывается с
чужеродным веществом, начиная процесс выведения чужеродного вещества из
организма.
Молекула антитела в основном образована четырьмя полипептидными
цепями, образующими основную единицу: Две идентичные тяжелые (H) цепи
(MW 53 000-75 000) и две легкие (L) цепи (MW 23 000), соединенные
дисульфур-связями. В молекуле антитела есть две области. К ним относятся
общая фракция (Fc) и переменная фракция (Fab).
Fc: Состоит из части тяжелой цепи.
Fab: Эта фракционная цепь (MW 50,000) определяет специфичность
антител и состоит из другой части тяжелых цепей (MW 1,00,000).
Иммуноглобулины, состоящие из более чем одной основной мономерной
единицы, называются полимерами. Электрофоретические и
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]