Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
161
групп/видов и далее на патогенные микроорганизмы в зависимости от хозяина,
которого они заражают. Род Erwinia делится на четыре группы/вида. Род
Pantoea делится на два вида. Род Clavibacter (corynebacterium) делится на
четыре вида. Род agrobacterium делится на четыре группы/вида, и в каждой
группе содержится определенное количество биоваров, в зависимости от
биохимических тестов.
Таким образом, биохимические тесты играют важную роль в
дифференциации бактериального изолята на отдельные виды или биовары.
Дифференциация различных родов на группы/виды/биовары
проиллюстрирована в следующих таблицах.
162
21. ИДЕНТИФИКАЦИЯ РАС БАКТЕРИАЛЬНЫХ
ПАТОГЕНОВ РАСТЕНИЙ
Вариация реакции (восприимчивая или устойчивая) бактериального
изолята зависит от сорта растения-хозяина. Растение-хозяин с различным
генетическим составом по-разному реагирует на один и тот же бактериальный
изолят, вызывая восприимчивую или устойчивую реакцию, и это формирует
основу для вариации данного вида бактерий или патогенов. Изоляты
патоваров, на основании их реакции на различные
генотипы/сорта/разновидности культуры-хозяина, далее подразделяются на
расы.
Эти расы специфичны в нападении на определенный генотип культуры,
а не на другой генотип. На основании дифференциальной реакции сортовхозяев определяется раса данного возбудителя.
21.1. Идентификация рас X. campestris pv. campestris (Xcc)
Kamoun et al. (1992) разделили изоляты X. campestris pv. campestris на
пять различных рас (от 0 до 4) на основе реакции некоторых сортов репы (B.
Rapa) и сорта горчицы (B. Juncea).
Vicente et al. (1998) предположили, что расу 1 можно разделить на три
расы (ориентировочно, 1a, 1b и 1c) на основе их реакции на несколько
присоединений B. Oleracea и одну из B. Carianata. В 2001 году они изучили 164
изолята Xcc и других патогенов X. campestris, которые, как известно, заражают
крестоцветных хозяев путем инокуляции на дифференциальную серию Brassica
spp. для определения патогенности для капусты и расы. Они сгруппировали 144
изолята X. campestris pv. campestris в шесть рас (1-6), причем преобладали расы
1 (62%) и 4 (32%).
Набор из шести дифференциальных хозяев крестоцветных, как показано
ниже, используется для характеристики рас Xcc:
1. Просто Правильная Репа F1
2. Семь лучших репу
163
3. Индийская горчица (сарептская Б.) широколиственные Флорида
4. цветная капуста (B. Oleracea var.) Чудо F1
5. капуста вироса F1
6. ПИ 199947 (Б. Каринац)
Необходимый Материал
Дифференциал хозяина крестоцвета, культура X. c. pv. campestris, шприц
для подкожных инъекций, дистиллированная вода, утилизирующая игла, бирки
и так далее.
Методика
Высаживайте семена шести разных хозяев крестоцветных отдельно в
отдельные горшки или в поле. Когда растениям исполняется не менее месяца,
их листья используют для прививки бактериальной суспензии.
Приготовьте бактериальную суспензию Xanthomonas campestris pv.
campestris при 0,1 OD и инокулируйте в дорсальную сторону листьев
вышеуказанного дифференциала хозяина методом подкожной шприцевой
инокуляции или тампонной инокуляции. Пометьте листья растения правильно
для соответствующей бактериальной культуры.
Поддерживайте растение во влажном состоянии в течение 46 часов, а
затем при полевой температуре (28 = 2°C) для развития симптома черной
ножки или симптома почернения вен. Запишите наблюдение на 8-10 – й день
инокуляции как + (симптомы заболевания) или - (отсутствие симптомов
заболевания) для определения расы возбудителя (табл. 21.1).
21.2. Идентификация рас X. axonopodis pv. malvacearum
Необходимый Материал
Хлопковое дифференциальное растение, культура Xanthomonas
axonopodis pv. malvacearum, шприц для подкожных инъекций,
дистиллированная вода, утилизационная игла, бирки и т. д.
Наименование хлопковых дифференциалов/CVs: Acala-44, stonevil 2B S9,
Stonevil-20, mebane B-1, 1-10B, 20-3, 101-102 B.
Методика
164
Высадите семена вышеуказанных дифференциалов либо в горшок, либо
в поле и поднимите хлопчатник. Когда растениям исполняется не менее месяца,
их листья используют для прививки бактериальной суспензии.
Приготовьте бактериальную суспензию Xanthomonas axonopodis pv.
malvacearum в дозе 0,1 OD и инокулируйте в дорсальную сторону листьев
вышеуказанных дифференциалов хлопчатника путем подкожной шприцевой
инокуляции.
Пометьте листья растения правильно для соответствующей
бактериальной культуры.
Выдерживают растение во влажном состоянии в течение 48 часов, а затем
выдерживают при полевой температуре (28 ± 2°С) для развития реакции
замачивания водой (+) или реакции гиперчувствительности (HR).
Гиперчувствительная реакция потемнения обычно развивается к 48
часам, в то время как восприимчивая реакция замачивания воды развивается к
третьему дню и далее. Регистрируют реакцию на четвертый день для
определения расового числа бактериальной культуры (табл. 21.2).
Подразделение рас Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum 18 на основе
дополнительного дифференциала хозяина было предложено Бхосале и
Боркаром (2011). Эта раса была Далее разделена на два биотипа с помощью
дополнительного дифференциала хлопка (табл. 21.3).
Название дополнительного дифференциала хлопка: Gregg и DPX4.
21.3. Идентификация рас X. axonopodis pv. viticola
Необходимый Материал
Виноградная лоза дифференциальный, культура бактерии виноградной
лозы, шприц для подкожных инъекций, дистиллированная вода,
утилизирующая игла, бирка и так далее.
Название виноградных дифференциалов: Thompson seedless/Haithi; Tas-
A Ganesh/Bhokari; Perlette/Arkashyam; Beautiseedless/Kalisahebi Arkawati/Dogris
America, andCheninBlanc/KarolinaBlackrose.
165
Методика
Приготовьте бактериальную суспензию бактерии виноградной лозы в
дозе 0,1 ОД и инокулируйте в дорсальную сторону листьев вышеуказанных
дифференциальных растений виноградной лозы путем подкожной шприцевой
инокуляции. Пометьте листья растения правильно для соответствующей
бактериальной культуры. Прививка должна быть сделана во время сезона
дождей или влажного сезона, чтобы поддерживать естественную влажность
для развития реакции болезни. Реакция замачивания воды развивается в
течение 72-96 часов на восприимчивых cvs виноградной лозы. Запишите
реакцию как + (реакция болезни при замачивании в воде) или – (отсутствие
реакции или резистентная реакция), чтобы определить расовый номер
бактериальной культуры (таблица 21.4).
21.4. Идентификация рас X. oryzae pv. oryzae
Характеристика рас проводилась с использованием 10
дифференциальных сортов риса. Дифференциалы таковы
1. 1RRB-1 (ген резистентности xa-1)
2. 1RRB-3 (ген резистентности xa-3)
3. 1RRB-4 (ген резистентности xa-4)
4. 1RRB-5 (ген резистентности xa-5)
5. 1RRB-7 (ген резистентности xa-7)
6. 1RRB-10 (ген резистентности xa-10)
7. 1RRB-11 (ген резистентности xa-11)
8. 1RRB-13 (ген резистентности xa-13)
9. 1RRB-14 (ген резистентности xa-14)
10. 1RRB-21 (ген резистентности xa-21)
11. 1R24 (отсутствие гена резистентности)
Десять близких изогенных линий с одним геном резистентности, как
указано выше (Huang et al., 1997), были разработаны как международные
дифференциальные разновидности изолятов BCB, а 1R 24 использовался в
качестве чувствительного чека.
166
Необходимый Материал
Одиннадцать дифференциальных риса, резюме; бактериальные культуры
Х. О. ПВ. oryzae, ножницы, теги, и так далее.
Методика
Высевают семена этих сортов в пластиковый горшок и через 20 дней
пересаживают рассаду в горшки, содержащие естественную рисовую почву.
Выращивайте рисовые растения в тепличных условиях. Бактериальная
прививка проводится, когда растениям риса исполняется 40 дней. Готовят
бактериальную суспензию для инокуляции с использованием 48-часовых
культур каждого изолята в 20 мл стерильной воды и доводят до 108 КОЕ/мл.
Полностью развернутые листья инокулируют бактериальными инокулятами
методом срезания листьев (Kauffman et al., 1973).
Измерьте длину поражения от срезанной верхушки листа в сантиметрах
(см) через 18 дней после прививки и классифицируйте реакцию заболевания в
соответствии с длиной поражения. чтобы определить расовое число
бактериальной культуры (таблица 21.4).
Длина поражения от 0 до 6 см классифицируется как резистентность (R),
а более 6 см-как восприимчивость (s) (Sanchez et al., 2000).
Шесть рас или патотипов идентифицируются на основе
дифференциальной реакции этих хозяев (таблица 21.5).
Большинство рас, продуцирующих восприимчивую реакцию, производят
ту же длину поражения, что и у восприимчивой контрольной разновидности
1R24.
21.5. Идентификация рас Ralstonia solanacearum
Пять рас Ralstonia solanacearum можно дифференцировать по
дифференциалу хозяина Solanaceae и соответствующему растению-хозяину,
где индуцируются симптомы увядания.
Необходимый Материал
Дифференциал хозяина Solanacearum, бактериальная культура Ralstonia
solanacearum, ножницы, бирки и так далее.
167
Методика
Поднимите дифференциальное растение-хозяин из семян (помидор,
перец чили, бринджал, табак). Когда они будут готовы к пересадке,
выкорчевывайте их. Обрезают их корни ножницами, погружают в
бактериальную суспензию (0,1-10 КОЕ/мл) на 5 минут и пересаживают в
горшки.
Травмируйте клубень картофельного побега, корневище имбирного
побега, корневище бананового побега и его сородичей булавочными уколами
и окуните в бактериальную суспензию на 5 минут. Травмируйте корень
шелковицы и перец нарезкой и окуните в бактериальную суспензию на 5
минут.
Посадите эти бактериальные инокуляты обработанные
трансплантаты/корневища/черенки в горшечную почву и промойте горшечную
почву бактериальными инокулятами. Поддерживайте дифференциальные
растения в тепличном влажном состоянии для развития симптомов болезни
увядания. Наблюдайте за увяданием растений от 20 дней и до 45 дней, чтобы
определить расовую численность Ralstonia solanacearum (табл. 21.6).
Дифференцирование расы значения, Ralstonia у биоваров:
дифференциация рас значения, Ralstonia solanacearum в биоваров основан на
использовании углеводов.
Необходимый материал
Среда/бульон из соответствующего углевода, бактериальная культура
ралстонии, инокуляционные иглы и так далее.
Методика
Приготовьте среду/бульон из соответствующего углевода, стерилизуйте
и инокулируйте бактериальной культурой.
Инкубируйте инокулированные пробирки при температуре 28 ± 2°С в
течение 96 часов и регистрируйте утилизацию углеводов.
Различные биовары окисляют/утилизируют различные углеводы. Исходя
из утилизации углеводов, они называются биоварами 1-4 (табл. 21.7).
168
169
22. ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ,
СВЯЗАННЫХ С БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКОЙ
Бактериальная клеточная стенка обеспечивает жесткую структуру и
форму бактериальной клетки. Бактериальная клеточная стенка также помогает
дифференцировать бактерии на грамположительные или грамотрицательные
группы в зависимости от состава клеточной стенки. Клеточная стенка также
обладает антигенными свойствами. Соединения, связанные с клеточной
стенкой, продуцируемые фитопатогенными бактериями, играют важную роль
в индукции реакции замачивания болезнетворных вод (WS) в растении-хозяине
(Borkar, 1989). Поэтому, клеточной стенки и клеточной стенки-связанная
биологических соединений являются важными для изучения Borkar и Vermna
(1991 годаА).
22.1. ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
(ПЕПТИДОГЛИКАН)
Бактериальная клеточная стенка имеет решающее значение для
определения формы клеток во время роста и деления и поддерживает
механическую целостность клеток перед лицом тургора давлений в несколько
атмосфер по величине. В различных формах и размерах бактериального
царства клеточная стенка состоит из пептидогликана, макромолекулярной сети
сахарных нитей, сшитых короткими пептидами.
Получение пептидогликана начинается либо с интактных бактерий, либо
с ранее изолированной клеточной стенки. Изоляция клеточной стенки
осуществляется путем дезинтеграции клетки с помощью ультразвука,
многократного замораживания и оттаивания, сильных сдвиговых усилий или
шлифования кварцевым песком. Клеточную стенку можно отделить от других
компонентов клетки дифференциальным центрифугированием.
Ниже кратко излагаются стандартные процедуры получения
пептидогликанов грамположительных и грамотрицательных бактерий.
170
Грамположительные бактерии
Необходимый материал:
• Формамид (150-180°C в течение 30 минут)
• HNO3, 0,8 м (37°C в течение 15 минут)
• Трихлоруксусная кислота, 5-25% (90°C в течение 10 минут, затем O°C в
течение нескольких дней)
• H2SO4, 0,1 Н (60°C в течение 24 часов)
• NaOH, 0,1 Н (100°C в течение 1 часа, затем 35°C в течение 8 часов)
• Дезоксихолат, 1 процент (O°C в течение 16 часов)
• N,N, диметилгидразин, 2% (80°C в течение 2 часов)
Грамотрицательные бактерии
Необходимый материал:
• Фенол-вода (45:55) при температуре 68°C в течение 5-35 минут
• Додецилсульфат натрия, 4% при 100°C
22.1.1. Выделение и подготовка бактериальной клеточной стенки для
композиционного анализа методом ультраэффективной жидкостной
хроматографии (UPLC)
Этот метод описан Desmarais et al. (2014). Высокоэффективная
жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является мощным аналитическим
методом для количественной оценки различий в химическом составе стенок
бактерий, выращенных в различных средах и генетических условиях, но ее
пропускная способность часто ограничена. Простой процедурой выделения и
подготовки бактериальной клеточной стенки для биологического анализа
пептидогликана является ультраэффективная жидкостная хроматография
(UPLC).
Этот метод используется для получения такой информации, как
идентификация муропептидных компонентов и их концентраций, средняя
длина гликановых нитей и доля материала, участвующего в поперечных связях
между нитями. Протокол выглядит следующим образом:
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]