Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
71
После инкубации пластины исследуют на наличие отдельных колоний,
растущих по всей среде. Чистые колонии, которые имеют разный размер,
форму и цвет, могут быть изолированы/перенесены в питательную среду
пробирки для получения чистых культур.
Наливные тарелки также используются в качестве средства определения
количества жизнеспособных организмов в жидкости, такой как вода, молоко,
моча или бульонная культура, а также для определения гемолитической
активности глубоких колоний некоторых бактерий, таких как стрептококки, с
помощью агаровой среды, содержащей кровь.
Необходимый материал
Двадцатичетырехчасовой питательный бульон культур смешанных
бактерий, питательная агаровая среда, стерильные 9-мл водные заготовки,
стерильные пластины Петри, стерильные 1-мл пипетки, стойка для пробирок,
водяная баня, Бунзеновская горелка, восковой маркировочный карандаш.
Методика
Поместите питательную агаровую среду в кипящую водяную баню для
плавления. Дайте ему остыть до 45°C. Готовят последовательное разведение
смешанной бактериальной культуры до 10-4. Также маркируйте пластины
Петри и асептически переносите 1 мл бактериальной суспензии из каждого
разведения на отдельные пластины, которые ранее были номерными.
Извлеките колбу питательной агаровой среды из водяной бани (при 45°С),
налейте среду (20 мл) в эти пластины и осторожно поверните пластину, чтобы
обеспечить равномерное распределение клеток в среде. Разрешить среды,
чтобы укрепить. Инкубируют инокулированные пластинки в течение 24-48
часов при температуре 28 ± 2°С в перевернутом положении.
Исследуйте пластины на предмет появления отдельных колоний,
растущих по всей агаровой среде. Будет замечено, что постепенно налитые
пластины будут иметь все меньшее и меньшее число колоний, которые будут
распределены более или менее редко в пластинах, которые могут быть
72
перенесены (субкультурно) на другие среды (свежие пластины) или агаровые
наклонные для дальнейшего изучения.
Особенности
Среда, которая должна быть разлита в пластины Петри, должна иметь
температуру 45°C. Пластины следует инкубировать в перевернутом
положении, чтобы предотвратить образование конденсата на поверхности
агара. Если поверхность не сухая, то будет трудно получить дискретные
поверхностные колонии.
11.3. Методом разбрасывания пластин
Метод разбросанных пластин используется для разделения
разбавленной, смешанной популяции микроорганизмов, так что отдельные
колонии могут быть изолированы. В этом методе микроорганизмы
распределяются по затвердевшей агаровой среде стерильным Г-образным
стеклянным стержнем, а чашку Петри вращают на поворотном столе. Теория,
лежащая в основе этого метода, заключается в том, что по мере вращения
чашки Петри на определенном этапе отдельные клетки будут осаждаться с
помощью изогнутого стеклянного стержня на поверхность агара. Некоторые из
этих клеток будут отделены друг от друга расстоянием, достаточным для того,
чтобы колонии, которые развиваются, были свободны друг от друга.
Необходимый материал
Двадцатичетырехчасовой питательный бульон культур известной
бактериальной смеси, питательные агаровые пластинки, поворотный стол lazy
susan, Г-образный изогнутый стеклянный стержень, 95-процентный спирт,
мензурка (50 мл), Бунзеновская горелка, восковой маркировочный карандаш.
Методика
Маркируйте питательные агаровые пластинки с бактериальными видами
восковым карандашом. Налейте 95 - процентный спирт в мензурку и окуните в
нее изогнутый стеклянный стержень. Асептически переносят петлевую
культуру смешанной бактерии в центр соответствующим образом
73
маркированной питательной агаровой пластины. Поместите привитую
пластину на поворотный стол.
Извлеките стеклянный стержень из мензурки и стерилизуйте согнутую
часть в пламени горелки Бунзена. Охладите стержень в течение 10-15 секунд.
Снимите крышку чашки Петри и поверните поворотный стол. Слегка
прикоснитесь стерильным изогнутым стержнем к поверхности агара и двигайте
его вперед и назад, Пока вращается поворотный стол для распространения
культуры по поверхности агара. Замените крышку чашки Петри, когда
поворотный стол перестанет вращаться. Погрузите изогнутый стержень в
спирт и оплавите, чтобы стерилизовать его. Инкубируйте все три пластины в
перевернутом положении при температуре 28 ± 2°С в течение 24-48 часов.
Понаблюдайте за всеми привитыми пластинками относительно
распределения колоний на каждой из пластинок агара; некоторые из колоний
будут свободны друг от друга. Выберите отдельную колонию из первой и
второй пластинки и запишите их форму, высоту, пигментацию и размер
колонии.
74
12. ПОДДЕРЖАНИЕ И СОХРАНЕНИЕ ЧИСТЫХ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР
Как только бактерия выделена в чистом виде, ее субкультурируют на
пластинах или наклонных агарах (трубка, содержащая твердую среду,
приготовленную путем удержания трубки наклоненной по мере затвердевания
агара; результирующая наклонная поверхность обеспечивает большую
площадь и легче прочерчивается, чем горизонтальная поверхность) через
регулярные промежутки времени для поддержания жизнеспособности.
Интервал между субкультурами, который меняется каждые две недели или
месяц, зависит от условий хранения и скорости роста организмов. Бактерию
можно культивировать на питательных средах, специально разработанных для
обеспечения низких темпов роста и продления жизни культуры. Хранение
культур в холодильнике при температуре 4°С, что замедляет рост,
предохраняет от повреждения вследствие испарения среды и резервирует
культуру. Субкультура охлажденных культур должна проводиться с
регулярными интервалами в две недели.
Желательно поддерживать два уклона: один-как рабочую культуру,
которая будет использоваться в качестве источника для рутинной
лабораторной работы, а другой-как запасную культуру, из которой при
необходимости готовятся новые рабочие культуры. Такая система снижает
вероятность заражения животноводческой культуры.
Уход за маточными культурами требует большой осторожности. Чтобы
сохранить бактерии, необходимо свести их метаболизм к минимуму. В
результате замедляются процессы, приводящие к старению и гибели, и
бактерия может находиться в неактивном состоянии в течение нескольких лет.
Лиофилизация (сублимационная сушка) или замораживание в жидком азоте
используется для сохранения бактерий, где они могут сохранять
жизнеспособность в течение нескольких лет.
75
Существует несколько методов поддержания чистоты культур; выбор
метода зависит от цели, размера коллекции и лаборатории. Некоторые из
наиболее часто используемых методов заключаются в следующем.
12.1. Сохранение на носителях ygca
Растительные патогенные бактериальные культуры поддерживаются на
дрожжевой глюкозо–меловой агаровой среде, а не на обычной питательной
сахарозо–агаровой среде. Благодаря присутствию в среде карбоната кальция
рН среды остается постоянным для поддержания жизнеспособности бактерий.
На средах YGCA бактериальные культуры могут поддерживаться до 3 недель.
12.2. Консервация в холодильнике или холодильной камере хранения
Живые культуры на питательной среде можно успешно хранить в
холодильниках или холодильных камерах при температуре 4°С. Как правило,
метаболическая активность микроорганизмов значительно замедляется при
этой температуре, но не настолько, чтобы полностью остановить метаболизм.
Таким образом, рост будет происходить медленно, а питательные вещества
будут утилизироваться и образовываться отходы, которые в конечном итоге
убьют микроорганизм. Поэтому необходима регулярная субкультура, которая
колеблется от интервала в 2-3 недели.
12.3. Консервация в минеральном масле
Это простой и экономичный способ сохранения бактерий, где они
остаются жизнеспособными в течение нескольких месяцев при комнатной
температуре. В этом методе стерильный жидкий парафин заливают поверх
наклонной культуры бактерии и хранят вертикально при комнатной
температуре. Слой парафина предотвращает обезвоживание среды, и,
76
обеспечивая анаэробные условия, микроорганизмы остаются в спящем
состоянии.
12.4. Консервация при температуре -40°c в глицерине
Культуры можно хранить в течение нескольких лет в глицерине при
температуре -40°С в глубокой заморозке. В этом методе к агаровой наклонной
культуре добавляют приблизительно 2 мл раствора глицерина; культуру
эмульгируют встряхиванием. Эмульгированную культуру переносят по 0,5 мл
в каждую ампулу, которую помещают в смесь промышленного
метилированного спирта и углекислого газа и быстро замораживают до -70°С.
Ампулы извлекают из смеси и помещают непосредственно в глубокую
морозильную камеру при температуре -40°С. Для оживления культур ампулы
помещают на водяную баню при 45°С на несколько секунд или до тех пор, пока
суспензии не расплавятся и не будут асептически нанесены на агаровые
пластины.
12.5. Консервация в съедобных/несъедобных маслах
В отдаленных местах или отдаленных лабораториях, где минеральные
масла недоступны, съедобные/несъедобные масла могут быть использованы
для сохранения бактериального патогена растений. О сохранении
растительных патогенных бактериальных культур в съедобных/несъедобных
маслах сообщалось в лаборатории профессора Боркара в 2007 году (Birajdar,
2007).
Нанесите чистую бактериальную культуру на питательный агар,
наклоненный в пробирках. После 48 часов роста бактерий пищевые масла,
такие как арахисовое масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло и
кунжутное масло, могут быть использованы для сохранения бактериальной
культуры. Любое из этих масел можно добавлять в пробирку до тех пор, пока
культуральный уклон не будет погружен в масло. Эти пробирки можно хранить
при комнатной температуре, где бактерии остаются жизнеспособными в
течение трех месяцев.
77
Среди несъедобных масел было отмечено, что касторовое масло и
хлопковое масло являются консервантами, где бактерии остаются
жизнеспособными в течение двух месяцев и полутора месяцев соответственно.
12.6. Консервирование методом жидкого азота (хранение при низких
температурах)
Замораживание в жидком азоте при температуре -196°С
приостанавливает метаболизм клеток, и они выживают в неизменном виде в
течение длительных периодов времени. В этом методе клеточную суспензию в
присутствии стабилизирующего агента, такого как глицерин или
диметилсульфоксид (ДМСО), который предотвращает образование кристаллов
льда, которые могут убить замороженные клетки, герметизируют в небольшие
ампулы и хранят в холодильнике с жидким азотом (-196°C). Большинство
видов бактерий могут оставаться жизнеспособными от 10 до 30 лет и даже
больше, не меняя своих характеристик.
12.7. Консервация парафиновым методом
Это очень простой, экономичный и успешный метод хранения культур
бактерий. Микробы остаются жизнеспособными в течение нескольких лет при
комнатной температуре. Во время оживления или переноса из промасленных
культур петлю культуры удаляют и инокулируют на наклонном агаре или
бульонной трубке.
Необходимый материал
Наклонная культура бактерии, жидкий парафин (в колбах), духовка (при
180°С).
Методика
Стерилизовать жидкий парафин при температуре 180°С в духовке в
течение 1 часа. Вылейте достаточное количество стерилизованного парафина
на наклонную (наклонную) культуру бактерий так, чтобы парафин образовал
слой примерно на полдюйма выше поверхности агара. Храните агар наклонно
вертикально при комнатной температуре. Во время переноса из сохраненной в
78
парафине культуры нарисуйте петлю культуры и инокулируйте на свежий
уклон агара или в пробирку с бульоном.
Особенности
При стерилизации парафина колбы следует хранить в металлическом
ящике перед помещением их в печь, чтобы избежать загрязнения из-за
образования неприятного запаха при нагревании. К наклонной культуре
следует добавить достаточное количество парафина, чтобы он полностью
покрывал поверхность агара; в противном случае трубка со временем будет
обезвожена.
12.8. Консервирование методом сублимационной сушки (лиофилизации)
Сублимационная сушка (лиофилизация)-это быстрое обезвоживание
организмов, пока они находятся в замороженном состоянии.
Большинство микробов защищены от повреждений, вызванных потерей
воды этим методом. Поскольку метаболизм требует воды, организмы
находятся в спящем состоянии и могут сохранять жизнеспособность в течение
более 30 лет без изменений в своих характеристиках. В этом методе культуру
быстро замораживают при температуре -70°C, а затем обезвоживают вакуумом,
а пробирки, содержащие лиофилизированные культуры, герметизируют и
хранят в темноте при температуре 4°C в холодильниках.
Метод сублимационной сушки часто используется для хранения культур
в национальных/международных центрах сбора культур мира, так как
обезвоженные (лиофилизованные) культуры сохраняют свою
жизнеспособность в течение нескольких лет.
Необходимый материал
Ампулы из стекла Corning или Borosil, небольшая полоска
фильтровальной бумаги, стерильные пипетки по 1 мл, вата, печь,
сублимационный сушильный аппарат.
Методика
На маленькой полоске фильтровальной бумаги нанесите карандашом
кодовый номер или название организмов.
79
Стерилизуйте ампулы в духовке при температуре 180°С в течение 1 часа.
Налейте от 0,25 до 0,5 мл бульонной культуры в стерилизованную ампулу.
Приложите ватную пробку, которая полностью вдавливается в ампулу.
Подсоедините ампулу к отверстию в центрифужной головке лиофильносушильного аппарата. Центрифугирование продолжается в течение 7 минут,
что приводит к быстрому обезвоживанию и замораживанию содержимого
ампул. Оставьте эти ампулы для первичного обезвоживания на 6 часов.
Горлышки ампул вытягиваются, и ампулы подвергаются вторичному
обезвоживанию в течение 12 часов. Запечатайте ампулы под вакуумом и
храните их при температуре 4°C на столе. Исследуйте ампулы на
герметичность с помощью вакуумного тестера.
Получение голубого свечения свидетельствует о достаточно низком
давлении, то есть о правильной герметизации ампул.
Восстановление культуры
Во время вскрытия ампулы горлышко ампулы воспламеняется, и вокруг
ампулы делается царапина напильником, соответствующая экватору ватной
пробки. Откройте ампулу, надавив на царапину. Снимите ватную пробку и
сожгите горлышко ампулы. Используя стерильную пастеровскую пипетку,
добавьте в ампулу 0,2 мл бульона. Держите его для регидратации в течение
нескольких минут.
Перенесите регидратированную культуру в пробирку с бульоном,
используя свежую стерильную пипетку. Инкубируйте инокулированную
бульонную пробирку при температуре 28 ± 2°С в течение 24 часов. Очистите
пластинку агара от инкубированной культуры. Инкубируйте инокулированную
пластинку при температуре 28 ± 2°С в течение 24 часов. Сравните колонии с
характеристиками культуры/бактерии, которая была лиофилизирована.
80
13. ОКРАШИВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР ДЛЯ
МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Некоторые микроорганизмы не могут быть изучены должным образом,
потому что они прозрачны или бесцветны и поэтому их трудно увидеть, когда
они взвешены в водной среде. Поэтому образцы обычно окрашивают, чтобы
повысить видимость и выявить дополнительную информацию, которая
поможет идентифицировать микробы. Сегодня существует несколько методов
окрашивания и окрашивания для изучения свойств различных
микроорганизмов и их дифференциации на определенные группы/роды/виды.
Химические вещества, обычно используемые для окрашивания бактерий,
известны как красители. Красители классифицируются как натуральные или
синтетические; первые используются в основном для гистологических целей, а
вторые-в основном для бактериальных окрашивающих препаратов. Это
каменноугольные (анилиновые) красители. Химически краситель (пятно)
определяется как органическое соединение, содержащее бензольное кольцо
плюс хромосферу и ауксохромную группу. Такие красители бывают
кислотными, основными или нейтральными. Кислотные красители (например,
пикриновая кислота, кислотный фуксин, эозин) являются анионными и
окрашивают цитоплазматические компоненты клеток, которые являются более
щелочными по своей природе. С другой стороны, основные красители
(например, метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, сафранин)
являются катионными и соединяются с теми клеточными элементами, которые
имеют кислую природу (например, нуклеиновые кислоты). Нейтральные пятна
образуются при смешивании водных растворов некоторых кислых и основных
красителей. Красящее вещество в нейтральных пятнах присутствует как в
отрицательно, так и в положительно заряженных компонентах.
Окрашивающие растворы получают путем растворения определенного
красителя в дистиллированной воде или спирте. Пятно наносится на мазки в
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]