Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
61
культивировании материала, содержащего микроорганизмы, каждый
жизнеспособный микроорганизм будет развиваться в колонию.
Необходимый материал
Образец почвы, заготовка воды, носители NAS и PDA, пипетки,
стеклянная палочка.
Методика
Суспендируйте 1 г почвы в 10 мл дистиллированной воды и хорошо
встряхните. Дать отстояться и сделать последовательное разведение до 10-7.
Пипеткой выливают по 0,1 мл из каждого серийного разведения и пластинки
на NA и PDA пластинки индивидуально и распределяют с помощью
стеклянной палочки. Инкубируйте пластины в инкубаторе БПК при
температуре 28 ± 2°С в течение 48 часов, чтобы наблюдать развитие и типы
колоний бактерий/грибов/актиномицетов/дрожжей на питательных средах
концерна. Наблюдайте те же самые пластины и через 72 часа.
Наблюдайте за пластинками на предмет появления грибковых и
бактериальных колоний во всех инокулированных пластинках. Подсчитайте
количество микроорганизмов и их типы (бактерии и грибы), развившиеся на
питательном агаре и пластинках картофельного декстрозного агара, и
рассчитайте их популяцию на грамм почвы.
10.2. Выделение ризосферной микрофлоры
Термин ризосфера был введен в 1904 году немецким ученым Лоренцем
Хильтнером для обозначения области почвы, находящейся под влиянием
корней растений. Он определяется как область почвы, непосредственно
окружающая корни растения вместе с корневыми поверхностями.
Функционально ризосферу можно определить как область, простирающуюся
на несколько миллиметров от поверхности каждого корня, где микробная
популяция почвы находится под влиянием химической активности растения.
Регион обеспечивает определенные характерные условия для повышенной
встречаемости в нем микрофлоры, что объясняется богатым пищевым
материалом, обеспечиваемым добавлением отслоившихся участков корневых
62
тканей и корневых экссудатов, содержащих сахара, аминокислоты, витамины
и другие факторы роста, которые служат питательными веществами для
микроорганизмов в ризосфере.
Количество бактерий в ризосфере обычно превышает их количество в
соседней почве в десять, а часто и в несколько сотен раз. Отношение ризосферы
к почве (R:S), называемое ризосферным эффектом, может быть вычислено
путем деления числа микроорганизмов в почве ризосферы на число в почве,
свободной от роста растений. Больший ризосферный эффект наблюдается у
бактерий (Значения R:S от 10 до 100 или иногда больше), чем у актиномицетов
и грибов; в то время как в отношении простейших и водорослей наблюдаются
лишь незначительные изменения. Ризосферный эффект возрастает с возрастом
растения и обычно достигает своего максимума на стадии большего
вегетативного роста. После гибели растения микробная популяция постепенно
возвращается к тому же уровню, что и в окружающей почве.
Для изучения микрофлоры ризосферы из различных методик наиболее
широко используется метод разбавления почвы и подсчета пластин.
Необходимый материал
Свежесобранные корни, питательные агаровые пластины, Агаровые
пластины Чапека–Докса, стерильные заготовки для воды, Бутылка с
завинчивающейся крышкой, стерильные пипетки по 10 мл, стерильная вода,
стерильные чашки Петри, стерильные полиэтиленовые пакеты, горелка
Бунзена, стеклянный маркировочный карандаш и т. д.
Методика
Отделите ризосферную почву от пяти-шести корней с помощью щетки в
чашке Петри. Добавьте 10 г ризосферной почвы в 100 мл стерильной чистой
воды и встряхивайте ее в течение 15 минут на магнитном шейкере.
Приготовьте последовательные разведения от 10-2 до 10-6, как описано
в предыдущем эксперименте. Переносят по 1 мл каждого из разведений 10-4–
10-6 на стерильные пластины Петри (по три повторения на каждое разведение)
и заливают расплавленный и охлажденный (45°С) агар Чапека-Докса с
63
добавлением стрептопенициллина для выделения грибов при одновременном
добавлении питательных агаровых сред с добавлением аэрофунгина для
выделения бактерий и актиномицетов соответственно на различные пластины.
Инкубируют пластины CDA при температуре 25°C в перевернутом положении
в течение 7 дней, а пластины NA при температуре 30°C в течение 24-48 часов.
Наблюдайте за пластинками после инкубационного периода и
подсчитайте количество колоний грибов/бактерий/актиномицетов/дрожжей и
рассчитайте популяцию на грамм ризосферной почвы.
10.3. Выделение микроорганизма с поверхности корня
Необходимый материал
Корни растений, питательные агаровые пластины, картофельные
декстрозные агаровые пластины, водяная заготовка, мешалка, пипетки,
разбрасывающий стеклянный стержень и так далее.
Методика
Возьмите кусочки первичных, вторичных и третичных корней растения
и удалите прикрепленные частицы почвы с помощью щетки. Суспендируйте 1
г соответствующих кусочков корня в 10 мл дистиллированной воды и
перемешивайте на магнитной мешалке до тех пор, пока поверхность корня не
станет прозрачной. Из этого корня промывают, готовят последовательное
разведение до 10-6 и пластину на агаре Чапека–Докса и питательных агаровых
пластинах. Инкубируют пластинки в течение 7 дней при температуре 25°С в
перевернутом положении для колоний грибов и до 3 дней для колоний
бактерий/актиномицетов при температуре 28 ± 2°С.
Подсчитайте количество колоний грибов/бактерий/актиномицетов и
рассчитайте популяцию для каждого сантиметра длины корня
соответствующего корня (первичного, вторичного, третичного и т. д.).
10.4. Выделение микроорганизмов из девственницы/необработанная/не
ризосферная почва
Необходимый материал
64
Целину, тарелки питательный агар, картофельный агар декстрозы плиты,
чистая вода, мешалка, пипетка, стеклянная палочка распространение, и так
далее.
Методика
Выделяют микроорганизмы из почвы методом последовательного
разбавления, как описано в разделе 10.1.
Наблюдайте за пластинками для появления колоний бактерий и
актиномицетов через 2-3 дня и для грибов через 4-5 дней. Продолжайте
наблюдение в течение 2 недель.
Запись данных и расчеты записывают данные о количестве колоний на
пластину в различных разведениях для бактерий, актиномицетов, дрожжей и
грибов в ризосферных, ризопланетных и не ризосферных почвах.
Идентифицируйте различные изоляты вплоть до родового/видового уровня и
ведите учет для каждого из них.
Количество микроорганизмов в ризосферных и не ризосферных почвах
на грамм почвы (в пересчете на сухой вес) рассчитывается по следующей
формуле:
10.5. Выделение микрофлоры филлопланов методом последовательного
разведения
Термин филосфера был введен Ф. Т. ластом в 1955 году для обозначения
окружающей среды на поверхности листьев. В 1965 году Ф. Т. ласт и Ф. К.
Дейтон предложили использовать филлоплан при описании местообитаний на
поверхности листьев. Термины филлосфера и филлоплан используются в
литературе взаимозаменяемо.
Филлоплан-это естественная среда обитания на листовой поверхности,
которая поддерживает гетерогенную популяцию, включающую как
патогенные, так и непатогенные микроорганизмы. Филлоплантовые микробы
охватывают широкий спектр микроорганизмов, включая дрожжи, нитчатые
грибы, бактерии, актиномицеты, сине-зеленые водоросли и даже папоротники.
Микрофлора филлопланов представляет особый интерес с различных точек
65
зрения, поскольку некоторые из них обладают антагонистическим действием
против грибковых паразитов, разрушают поверхностный воск и кутикулу
растений, продуцируют фитоалексины, действуют как источник аллергических
аэрозольных спор, влияют на ростовые процессы и корневую экссудацию
растений.
Для изучения микрофлоры филлопланта используется несколько
методов. Они классифицируются как прямые (прямые наблюдения, оттиск
пленки, очистка, сканирующая микроскопия, фазовый контраст,
флуоресцентное антитело и инфракрасная микроскопия) и культурные
(падение спор, покрытие, влажная камера, поверхностная стерилизация,
промывка листьев, мацерация листьев и оттиск листьев) методы. Из них
наиболее распространенными являются метод серийного разбавления пластин
и метод оттиска листа.
Необходимый материал
Свежие листья, стерильные полиэтиленовые пакеты, картофельная
декстрозная агаровая среда, питательная агаровая среда, 100 мл стерильной
водной заготовки, 9 мл стерильной водной заготовки, стерильные пипетки по
1 мл, стерильные пластины Петри, магнитная мешалка, пробковое сверло,
Бунзеновская горелка, стеклянный маркировочный карандаш.
Методика
Соберите свежие здоровые листья (всех возрастов), а также больные
листья (если таковые имеются) в свежие стерильные полиэтиленовые пакеты и
принесите в лабораторию. Вырежьте пять дисков диаметром 6 мм из каждого
листа с помощью стерильного пробкового сверла. Перенесите 50 дисков в 100мл водяную заготовку и перемешивайте диски в течение 20 минут с помощью
магнитной мешалки, чтобы вымыть филлопланную микрофлору с поверхности
листа в воду.
Готовят серийные разведения до 10-4. Перенесите 1 мл аликвот из
разведений 10-4 и 10-2 на стерильные пластины Петри (шесть повторений для
каждого разведения: три для грибов и три для бактерий и актиномицетов).
66
Влить растопленный и охлажденный (45-50°С) картофельный агар
декстрозы среднего и питательная среда агар (три тарелки за разбавления)
выше пластин. Инкубируют пластины при температуре 28 ± 2°С в
перевернутом положении до 7 дней.
Наблюдайте за питательными агаровыми пластинками через 2-3 дня и
картофельными декстрозными агаровыми пластинками через 5-7 дней
инкубации для появления колоний бактерий, актиномицетов и грибов
соответственно.
Подсчитайте колонии бактерий, актиномицетов и грибов, используя
счетчик колоний. Поскольку одна колония представлена одной спорой,
следовательно, все колонии определенного вида, появляющиеся на агаровой
пластинке, считаются за общее количество спор, клеток или размножений
этого конкретного вида в 1 мл суспензии.
Микробные изоляты очищают, применяя гифальный наконечник (в
случае грибов) или полосчатый метод (для бактерий). Очищенные культуры
затем идентифицируются до общего/специфического уровня.
10.6. Изучение микрофлоры филлопланов методом отпечатков листьев
Необходимый материал
Образцы листьев, картофельной декстрозы агаром, пластинки
питательного агара, горелку, восковой маркировочный карандаш.
Методика
Возьмите лист и прижмите его с дорсальной поверхности на мгновение к
агаровой поверхности пластинок картофельного декстрозного агара в трех
местах. Прижмите один и тот же лист с дорсальной поверхности к поверхности
питательного агара в трех местах. Теперь прижмите один и тот же лист с
вентральной поверхности к поверхностям как картофельного декстрозного
агара, так и питательной агаровой пластины, как указано выше. Инкубируют
пластины при температуре 28 ± 2°С в перевернутом положении до 7 суток.
67
Наблюдайте за питательными агаровыми пластинками после 48-72 часов
инкубации для появления колоний бактерий и актиномицетов и картофельных
декстрозных агаровых пластинок для колоний грибов.
Запишите данные о количестве колоний бактерий, актиномицетов и
грибов на отпечатке листа на пластинке и сделайте сравнение для микробных
популяций на дорсальной и вентральной поверхности листьев. Также обратите
внимание на положение конкретных микробных колоний на поверхности листа
в печати, чтобы определить их сродство к среде обитания.
68
11. ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ
Микроорганизмы, выделенные из различных субстратов или источников
(почва, воздух, загрязненная вода, больные растения, разлагающийся
зараженный растительный материал), должны быть получены в чистом виде,
так как культуры содержат миллионы или миллиарды отдельных клеток.
Культура, содержащая только один вид микроорганизмов, называется чистой
культурой. Культура, содержащая более одного вида микроорганизмов,
называется смешанной культурой; если она содержит только два вида
микроорганизмов, которые намеренно поддерживаются в ассоциации друг с
другом, она называется двухчленной культурой.
Чистые культуры необходимы для изучения характеристик колоний,
биохимических свойств, морфологии, реакций окрашивания и
иммунологических реакций или чувствительности к противомикробным
агентам. Два вида операций, то есть выделение (отделение конкретного
микроорганизма от инфицированного хозяина, индивидуально или в виде
смешанных популяций, существующих в природе) и очистка (рост одной
клетки в микробные популяции в виде культуры в искусственных средах
[культуральных средах] в лабораторных условиях), важны независимо от вида
микроорганизма, с которым имеет дело микробиолог.
Чистые культуры микроорганизмов, образующих дискретные колонии на
твердых средах, проще всего получить с помощью одной из модификаций
метода нанесения покрытий. Этот метод включает разделение и
иммобилизацию отдельных организмов на питательной агаровой среде или в
ней. Каждый жизнеспособный организм через рост дает начало колонии, из
которой легко может быть осуществлен перенос.
Тремя наиболее часто используемыми методами получения чистых
культур микроорганизмов являются (1) полосчатая пластина; (2) заливочная
пластина; и (3) растекающаяся пластина. Другие методы получения чистых
культур микроорганизмов включают: (1) Использование обогащающих сред;
69
(2) Использование дифференциальных и селективных сред; (3) Использование
сред, содержащих антибиотики; и (4) избранные методы культивирования
анаэробов.
11.1. Методом полосовых пластин
Метод полосовой пластины предлагает наиболее практичный метод
получения дискретных колоний и чистых культур. Первоначально он был
разработан двумя бактериологами, Фридрихом Леффлером и Джорджем
Гаффки, в лаборатории Роберта Коха. В этом методе стерилизованная петля
или переносная игла погружается в подходящую разбавленную суспензию
организмов, которая затем наносится на поверхность уже затвердевшей
агаровой пластины, чтобы сделать серию параллельных, неперекрывающихся
полос. Цель этого упражнения-получить колонии микроорганизмов, которые
являются чистыми, то есть рост, полученный из одной клетки/споры.
Необходимый материал
24-48-часовой питательный бульон из смеси или зараженной
колониальной культуры, питательные агаровые пластины, прививочная петля,
Бунзеновская горелка, восковой маркировочный карандаш.
Методика
С помощью воскового маркировочного карандаша обозначьте все
пластины на дне с названием организма(ов), подлежащего прививке. В левой
руке держите пробирку с бульоном из смешанной смеси. Простерилизуйте
петлю, держа ее в правой руке, снимите ватную пробку с помощью мизинца
правой руки и немедленно зажгите горловину трубки. Введите петлю в бульон
и извлеките одну петлю культуры. Зажгите горловину трубки, замените ватную
пробку и поместите трубку в стойку для пробирок. Поднимите крышку
пластины Петри левой рукой и держите ее под углом 60°. Поместите
инокуляты (петлю, содержащую каплю бульона) на поверхность агара на
самом дальнем от вас краю и проведите инокуляты из стороны в сторону
параллельными линиями по всей поверхности области. Оплавьте и охладите
петлю и поверните пластину Петри на 90°. Прикоснитесь петлей к углу
70
культуры в области 1 и проведите инокуляты через агар в области 2, как
описано выше (петля никогда больше не должна входить в область 1).
Остальная часть поверхности агара теперь используется для завершения
штриховки. Замените крышку пластины Петри после завершения штриховки и
стерилизуйте петлю пламенем. Инкубируют все пластины при температуре 2830°С в перевернутом положении в течение 48-72 часов.
После инкубации исследуйте каждую из трех пластинок на предмет роста
колоний. Сливающийся рост будет наблюдаться там, где была сделана
начальная полоса, рост будет менее плотным вдали от полосы, а дискретные
колонии будут находиться дальше всего от полосы (то есть в конце полосы).
Любая колония, не растущая на полосах, считается загрязнителем. Выберите
хорошо изолированную колонию из каждой пластины и запишите их
особенности. Если их особенности согласуются с первоначальным описанием,
то две исследуемые колонии являются чистыми культурами.
Особенности
Избегайте слишком сильного прижатия петли или иглы к поверхности
агара, так как это может повредить его. Инокуляционную петлю следует
охладить, прикоснувшись к поверхности агара, прежде чем поднимать
инокуляты для протравливания. Крышку пластины Петри никогда не следует
поднимать полностью. Нанесение покрытия на носитель следует производить
за 24 часа до выполнения упражнения, чтобы обнаружить загрязненные
пластины и выбросить их.
11.2. Методом заливки пластин
Предшественник настоящего метода заливки пластин был разработан в
лаборатории известного бактериолога Роберта Коха. В этом методе
последовательные разведения инокулятов (последовательно разбавляя
исходный образец) добавляют в стерильные пластины Петри, в которые
заливают расплавленную и охлажденную (42-45°C) агаровую среду и
тщательно перемешивают вращением пластин, которым затем дают затвердеть.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]