Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
101
пластине Петри, чем невирулентные изоляты, о чем свидетельствует
образование бактериальных колоний.
102
15. ОПИСАНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
КОЛОНИЙ
Морфология колоний является важным аспектом при обнаружении
растительных патогенных бактерий в изолирующих пластинках. Растительные
патогенные бактериальные колонии обычно развиваются после 48 часов
инкубации, в то время как сапрофитные не растительные патогенные
бактериальные колонии наблюдаются через 24 часа или даже в меньший
инкубационный период.
Обычно растительные патогенные бактерии производят круглые,
приподнятые, блестящие непигментированные или пигментированные
колонии на питательной агаровой среде или специализированной среде. Тип
колонии с пигментом колонии является важной характеристикой
бактериального рода и видов патогенных бактерий растений.
Ниже показаны различные типы колоний, их края, внутренняя структура
и пигмент колонии.
103
16. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ
(ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА РОСТ
БАКТЕРИЙ)
Окружающая среда влияет на рост и метаболизм бактерий и поэтому
непосредственно связана с индукцией или подавлением инициации
заболевания и развития симптомов бактериальным патогеном растений.
Температура является одним из наиболее важных физических факторов,
влияющих на микроорганизмы. Бактерии отличаются от высших растений и
животных отсутствием гомеостатического механизма и не могут регулировать
тепло, вырабатываемое метаболизмом, и поэтому непосредственно и легко
подвержены воздействию температуры. В ограниченном диапазоне температур
скорость ферментативно-катализируемых реакций возрастает в два раза при
каждом повышении температуры на 10°С.
Бактерии можно разделить на три основные группы в зависимости от их
температурных требований: 1) психрофилы, имеющие оптимальную
температуру от 0° до 20°C; 2) мезофилы, имеющие оптимальную температуру
от 20° до 40°C; и 3) термофилы, имеющие оптимальную температуру от 40° до
80°C. Термофилы бывают двух типов: 1) факультативные термофилы,
имеющие оптимальную температуру роста между 45° и 60°С; и 2) облигатные
термофилы, для которых 50° и 100°с находятся в смертельном диапазоне для
бактериальных клеток и спор. Диапазон температур, предпочитаемый
бактериями, определяется генетически, что определяет метаболические
процессы в бактериальных клетках.
Каждый организм растет в определенном температурном диапазоне (то
есть в кардинальных температурных точках). Минимальная температура роста
- это самая низкая температура, при которой будет происходить рост вида.
Самая высокая температура, при которой вид может расти, - это его
максимальная температура роста, а вид растет быстрее всего при оптимальной
температуре роста.
104
Время воздействия является жизненно важным фактором при оценке
летального действия высокой температуры на бактериальные клетки. Для этой
цели полезны два метода: (1) точка термической смерти (TDP), температура,
при которой организм погибает в течение 10 минут воздействия; и (2) время
термической смерти (TDT), время, необходимое для уничтожения суспензии
клеток/спор при данной температуре.
16.1. Влияние температуры инкубации на рост бактерий
Растительные патогенные бактерии, как и все другие бактерии, требуют
определенной температуры для роста. Это очевидно из того факта, что
некоторые виды патогенных бактерий растений преобладают в умеренных
регионах, в то время как некоторые виды бактерий преобладают в тропических
регионах, что указывает на то, что температура играет важную роль в росте,
размножении и метаболической деятельности, включая патогенность бактерии.
Поэтому важны исследования требований к температуре для данного вида
бактерий.
Необходимый материал
Бактериальных культур; скошенном питательном агаре; Бунзеновская
горелка; бактериологические петли; бактериологические иглы; установить
холодильник при температуре 4°С; четыре-инкубаторов установлен на уровне
15°С, 35°С, 55°С и 75°С.
Методика
Маркируйте каждый из скосов питательного агара тест-организмами
(бактериями) и температурой инкубации (0°C, 4°C, 15°C, 35°C, 75°C).
Инокулируйте шесть питательных агаровых скосов/пластин (маркированных
0°C, 4°C, 15°C, 35°C, 55°C, 75°C) тест-бактерией путем штриховки.
Инкубировать одну прививку косые и пластину из каждого комплекта при 0°С
(в морозилке холодильника) и 4°С (холодильник) в течение 10-14 дней и другой
ракурс и пластин при температуре 15°С, 35°С, 55°C и 75°C (в комплект
инкубаторов при этих температурах) в течение 24-48 часов.
105
Исследуйте культуры после двух дней инкубации (инкубировали при
15°C, 35°C, 55°C и 75°C) и после 10-14 дней инкубации (при 0°C и 4°C) на
наличие (+) или отсутствие (–) роста и степень роста; то есть минимальный
рост (+), умеренный рост (2+), тяжелый рост (3+) и очень тяжелый
(максимальный) рост (4+). Выражают полученные результаты и определяют
минимальный, максимальный и оптимальный температурные диапазоны для
исследуемой бактерии и классифицируют их как психрофильные,
мезофильные, ортермофильные.
16.2. Определение термической точки гибели бактерий (TDP)
Термическая точка смерти является важным аспектом, который следует
учитывать при лечении патогенных бактерий растений. В изменяющихся
условиях окружающей среды или климатических сезонах знание термической
точки гибели бактерий будет полезно для определения стратегий ее
управления.
Ферментативные реакции протекают с максимальной скоростью и
эффективностью при оптимальной температуре, которая изменяется в
зависимости от организма. Микробные ферменты становятся неактивными за
пределами максимальных и минимальных температурных экстремумов.
Высокие температуры вредны для микроорганизмов, поскольку они
денатурируют белки, вызывая необратимые изменения и полное разрушение
ферментов, что приводит к гибели клетки. Низкие температуры просто
оказывают инактивирующее действие на ферменты и, таким образом, менее
вредны для микроорганизмов. Температуры в диапазоне 50-100°C обычно
находятся в смертельном диапазоне для бактериальных клеток, но могут быть
значительные колебания в отношении продолжительности времени,
необходимого для их уничтожения, поскольку время воздействия является
жизненно важным фактором при оценке смертельного воздействия высоких
температур на микроорганизмы. Другими словами, смертоносное действие
тепла-это соотношение времени и температуры.
106
Для определения летального действия температуры на микроорганизмы
следует определить температуру термической смерти (TDP, т. е. температуру,
при которой организм погибает за 10 минут воздействия) и время термической
смерти (TDT, т. е. время, необходимое для уничтожения суспензии спор или
клеток при данной температуре) организма. Степень термоустойчивости
микроорганизма в лабораторных условиях можно определить путем
воздействия на клетки повышающейся температуры в течение фиксированного
периода, то есть 10 минут.
Необходимый материал
Питательный бульон культуры исследуемой бактерии (30-48 часов
культуры, взятой в колбах), питательные агаровые пластины, термостатическая
горячая водяная баня, стерильные пустые пробирки с крышкой, стерильные
ватные пробки 10 мл пипетки, культуральная трубка с 10 мл воды,
стоградусный термометр, маркировочный карандаш из воскового стекла,
подставка для культуральной трубки, прививочная петля/игла, горелка
Бунзена.
Методика
Разделите дно двух стерильных питательных агаровых пластин на шесть
секторов стеклянным маркировочным карандашом. Обозначьте шесть
секторов каждой пластины как 40°C, 50°C, 60°C, 70°C и 80°C. C (контроль)
означает без какой-либо температурной обработки. Составьте пять стерильных
пробирок для исследуемого организма и наклейте этикетку с температурой
40°C, 50°C, 60°C, 70°C и 80°C. Асептически переносят 2 мл питательной
бульонной культуры исследуемого организма в его соответствующим образом
маркированные пробирки с помощью стерильных пипеток. Держите пробирку
с тестируемой бактерией, помеченной 40°C, на водяной бане (убедитесь, что
вода в ванне находится выше уровня бульона), где температура воды
регулируется до 40°C, и держите пробирку в течение 10 минут при постоянной
температуре 40°C температура. Повторите те же действия для остальных
пробирок при другой температуре (50°C, 60°C, 70°C и 80°C) и сделайте
107
прививки из подвергнутого температурной обработке бульона и контрольного
бульона сразу же после температурной обработки в соответствующие
температурные сектора. Инкубируйте бактериальные инокулированные
пластины при температуре 30°C в течение 24-48 часов в перевернутом
положении или до тех пор, пока не произойдет рост в контрольных (с) секторах.
Изучите таблички на наличие (+) или отсутствие (–) роста во всех
секторах и сравните с контролем.
Из приведенных выше результатов находят точку термической гибели
(при которой происходит гибель организма) исследуемой бактерии.
Особенности
При проведении полосчатой инокуляции бактерии инокуляты должны
находиться на расстоянии не менее 1-2 см от центра пластины, где сходятся
секторы. Прививка бактерии может быть сделана на тарелке перед
охлаждением бульона. Постоянное внимание следует уделять температуре
водяной бани, чтобы можно было произвести регулировку до того, как
возникнут серьезные колебания температуры.
16.3. Определение времени термической гибели бактерий
Время, затраченное бактерией при данной температуре на то, чтобы
вызвать ее гибель, называется временем термической смерти (TDT).
Определение ТДТ, то есть продолжительности времени, в течение которого
бактерии подвергаются воздействию тепла, способствует летальному эффекту.
Степень их термоустойчивости можно оценить, подвергая бактериальные
клетки воздействию фиксированной температуры (определенной в
предыдущем эксперименте) в течение увеличивающихся периодов времени с
субкультурой, производимой в конце каждого временного интервала.
Необходимый Материал
Питательные бульонные культуры тестовых бактерий, питательные
агаровые средние пластины, стоградусный термометр, инокулирующая
петля/переносная игла, стерильные пустые трубки с крышкой,
термостатическая горячая водяная баня, маркировочный карандаш и так далее.
108
Методика
Разделите дно пластины питательного агара Петри на шесть секторов
стеклянным маркировочным карандашом и отметьте эти сектора следующим
образом 0, 3, 6, 9, 12, и 18; на другой пластине отметьте сектора как 21, 24, 27
и 30.
Асептически переносят 2 мл питательного бульона культуры
исследуемой бактерии в соответствующим образом маркированную
стерильную пробирку с помощью стерильных пипеток. Поместите первую
пробирку с исследуемой бактерией в водяную баню, установленную при
определенной температуре (как определено в предыдущем упражнении);
скажем, 40°С в течение 4 минут (1 минута для выравнивания температуры
бульона с водой и 3 минуты времени воздействия). Выньте трубку и быстро
охладите под водопроводной водой. Сделать прививки подряд на секторе 3 на
плиту. Теперь подержите другую пробирку, помеченную “6”, на водяной бане
и дайте 1 минуту, чтобы бульон и вода выровнялись, прежде чем начать
следующий интервал времени, например, 6 минут и повторите. Аналогично для
других временных интервалов 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, и 30. Инкубируйте
бактериальные инокулированные пластины при температуре 30°С в
перевернутом положении в течение 24-48 часов или до тех пор, пока рост не
произойдет в секторе времени “0”.
Понаблюдайте за привитыми пластинками на наличие роста в различных
секторах и сравните с “0” временным сектором. Запишите рост как + (рост
присутствует) и – (нет роста) и определите TDT самого быстрого организма, то
есть время, чтобы убить тестируемый организм при данной температуре.
Особенности
Уровень воды в водяной бане должен быть выше уровня бульона.
Температура водяной бани должна поддерживаться постоянной. После
определенной температурной обработки бульонные трубки следует
немедленно охладить, чтобы сделать прожилки.
109
16.4. Влияние рН на рост бактерий
РН-это символ логарифма обратной концентрации ионов водорода
(logI/H+) в граммах атомов на литр (т. е. (мощность) [H+]10). Например, рН 4
указывает на концентрацию 0,0001 или 10-4 грамма атомов ионов водорода в
одном литре раствора. Другими словами, значение рН является отрицательным
показателем концентрации Н+. Мера относительной кислотности или
щелочности раствора называется рН. рН выражается числом от 0 до 14. Более
кислый раствор при 0,01 (10-2) М имеет более низкое значение рН (рН = 2).
изменения рН окружающей среды оказывают глубокое влияние на рост,
деятельность и выживание бактерий. Каждая ферментная система организма
имеет определенный диапазон рН, в котором она может функционировать.
Подобно кардинальным температурным точкам, организм имеет
максимальный рН (т. е. концентрацию Н+ [щелочи], ниже которой организм не
может расти), оптимальный рН (т. е. концентрацию н+, при которой рост
организма максимален) и минимальный рН (т. е. концентрацию н+, при
которой рост организма максимален).
Н+ [кислоты], выше которой микроорганизм не может расти). Другими
словами, значения рН выше и ниже которых организм не может расти,
соответственно называются минимальной и максимальной концентрациями
ионов водорода. Ферменты сильно различаются по своим оптимумам рН.
Каждый вид бактерий обладает способностью расти в определенном
диапазоне рН, который может быть широким или ограниченным, причем
наиболее быстрый рост происходит в узком оптимальном диапазоне. Бактерии,
заражающие растительную систему, размножаются в тканях растений,
имеющих растительный сок, имеющий специфический рН. Сок различных
растений может иметь некоторые вариации, которые либо способствуют, либо
подавляют рост бактерий.
Поэтому требование рН является важным аспектом в изучении
бактериального патогена растений.
110
Хотя специфический диапазон рН для бактерий составляет от 4 до 9,
оптимальный рост обычно происходит между 6,5 и 7,5. но есть некоторые
заметные исключения, в том числе уксуснокислые бактерии и Тиобациллы
тиоксиданы, которые растут в кислых условиях рН ниже 4. Например, T.
Thioxidans переносит нормальную кислоту, то есть рН 0. Поэтому
органические кислоты используются для консервирования таких продуктов,
как кисломолочные продукты. Грибы обычно более толерантны к более
высоким кислотным условиям, чем бактерии, с оптимальной активностью при
рН от 4 до 6. Эти специфические потребности в РН отражают адаптацию
организма к природной среде. Это свойство используется в селективных средах
для роста грибов и бактерий.
Многие бактерии производят органические кислоты в результате
разложения углеводов и щелочи в результате распада белков, и они могут
подавлять рост из-за сдвигов рН. Буферы часто добавляют в питательные среды
для нейтрализации этих кислот и щелочей и поддержания равновесия.
Пептоны, белки и аминокислоты, благодаря своей амфотерной природе, в
сложных средах действуют как естественные буферы. Фосфатные соли часто
используются в химически определенных средах в качестве буферов.
Необходимый материал
Культуры тест-бактерий; пробирки, содержащие стерильный буферный
питательный бульон, доведенный до рН 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5, и 9,5 (три
пробирки для каждого рН, то есть всего 24 пробирки); прививочная
петля/переносная игла; горелка Бунзена; стерильные пипетки по 10 мл.
Методика
Пометьте каждую пробирку с питательным бульоном рН среды
(например, 2,5, 3,5,...) и название прививаемого организма. Инокулят каждую
из серий пробирок (рН 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5, и 9.5) с тестируемой
бактерией путем добавления 0,1 мл культуры в каждую пробирку.
Инкубировать бактериальные инокулированные пробирки в течение 24-48
часов при температуре 28 ± 2°С. После инкубационного периода нанесите
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]