Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
111
петлю инокулятов из каждой пробирки с рН на пластину питательного агара и
инкубируйте пластины в течение 48 часов при температуре 28 ± 2°C, чтобы
наблюдать рост или измерять рост бактерий в питательном бульоне
индивидуального рН в Спектронике 20 при 620 Нм после инкубационного
периода 48 часов и запишите значения оптической плотности для обозначения
роста.
Запишите рост тест-организмов, используя следующие символы: (–)
отсутствие роста, ( + ) незначительный рост, ( ++ ) умеренный рост и (+++)
наилучший рост. Исходя из полученных результатов, укажите оптимальный
рН, минимальный рН и максимальный рН для исследуемой бактерии.
16.5. Влияние концентрации соли на рост бактерий
Растения различаются по составу и содержанию солей. Растительные
патогенные бактерии могут широко варьировать по своей солеустойчивости.
В гипертонической среде (с высоким содержанием растворенных
веществ) все клетки теряют воду в результате осмоса и сморщиваются, что
называется цитолизом. Его влияние на размножение клеток является
ингибирующим. В гипотонической (с низким содержанием растворенных
веществ) среде вода поглощается клетками и набухает, что называется
плазмолизом. Гипотонические среды не оказывают вредного воздействия на
микроорганизмы, но в таких условиях клетки животных подвергаются лизису,
который вызывает гибель. Большинство природных сред с высокой
осмолярностью содержат высокие концентрации солей, в частности хлорида
натрия. Микроорганизмы, которые растут в этой среде, называются
галофилами. Бактерии можно разделить на две группы в зависимости от их
способности расти при различных концентрациях хлорида натрия:
Негалофильные (способные расти на средах, содержащих менее 2% хлорида
натрия) и галофильные (способные расти на средах, содержащих более 2%
соли). Галофильные могут быть также трех типов: Слабогалофильные (растут
при концентрации соли от 2 до 5 процентов), умеренно галофильные (способны
112
расти при концентрации соли до 10 процентов) и чрезвычайно галофильные
(способны расти при концентрации соли более 20 процентов).
Для определения влияния концентрации соли обычно используется
хлоридно-натриевая соль. Однако в качестве его содержания можно
использовать и другие соли, содержащиеся в соответствующих растениях.
Необходимый материал
Бульонные культуры исследуемых бактерий; питательные агаровые
пластины, содержащие соответствующие концентрации хлорида натрия (0,5%,
5%, 10%, 20%, 30% и 40%); горелка Бунзена; прививочная петля; восковой
маркировочный карандаш.
Методика
Инокулят исследуемую бактерию в питательные агаровые пластинки с
различной концентрацией соли, делая однолинейную петлевую инокуляцию.
Инкубируют все инокулированные пластинки при температуре 30°С в
перевернутом положении в течение 2-5 дней.
Наблюдайте за всеми питательными агаровыми пластинками различной
концентрации соли для роста тестируемой бактерии. Укажите степень роста
исследуемого микроорганизма, используя следующие символы: 0-отсутствие
роста, + - слабый рост, 2+ - умеренный рост и 3+ - обильный рост. Исходя из
полученных результатов определите диапазон концентраций соли, при
котором происходил рост, и оптимальную концентрацию соли для
исследуемых видов.
16.6. Влияние металлов на рост бактерий
Различные металлы присутствуют в почве и оросительной воде, на
которой выращиваются сельскохозяйственные культуры. Эти металлы
поглощаются через корневую систему и присутствуют в растении, чтобы
оказывать свое действие. Воздействие металлов на бактерии является
одновременно стимулирующим и ингибирующим. Например, железо
необходимо для роста микроорганизмов, хотя и желательно в малых
концентрациях; некоторые ионы (например, ртуть и серебро) токсичны в
113
малых концентрациях, в то время как некоторые металлы (например, медь)
ингибируют в умеренных концентрациях. С уменьшением концентрации ионов
металлов начинается рост, и при определенной концентрации происходит
нормальный рост. Способность некоторых металлов оказывать летальное
действие на бактерии называется олигодинамическим эффектом.
Градиент концентрации ионов металлов образуется, если кусок металла
поместить в агаровую среду, то есть максимальная концентрация ионов будет
немедленно окружать металл и будет происходить постепенное снижение
концентрации ионов через агар по мере увеличения расстояния от металла.
16.6.1. Олигодинамическое действие металлов (алюминия, меди и
свинца) на бактерии
Необходимый Материал
Бульонные культуры исследуемых бактерий, расплавленные
питательные агаровые среды при 50°с, стерильные пластины Петри,
стерильные пипетки по 1 мл, стерильные кусочки алюминия, меди и свинца,
щипцы, Бунзеновская горелка.
Методика
Инокулят 0,25 мл отварной культуры исследуемой бактерии в 20 мл
стерилизованной тепловатой питательной агаровой среды и тщательно
перемешивают инокуляты. Вылейте содержимое в стерильную тарелку Петри.
Сразу после заливки содержимого в каждую прививочную пластинку
асептически с помощью стерильных щипцов добавляют кусочек металла.
Держите одну пластину в качестве неинвазивного элемента управления, где не
было добавлено никакого металла. На каждой пластинке нанесите этикетку с
названием добавляемого металла и тестируемой бактерии. После
затвердевания среды инкубируют пластины при температуре 30°С в
перевернутом положении в течение 2 суток.
Понаблюдайте за инокулированными пластинками для роста бактерий и
сравните с контролем. Измерьте зоны ингибирования или зоны стимуляции,
если таковые имеются, бактерий с различными металлами.
114
Особенности
Перед затвердеванием агара в инокулированную пластину следует
добавить кусочек металла. Смешивание окуляров со средой можно
производить вращением колбы 3-4 раза.
16.7. Влияние красителей на рост бактерий
Красители часто используются в качестве антисептика. Кристаллическая
фиалка уже давно используется в терапевтических целях при грибковых
заболеваниях полости рта, монилиозе и молочнице. Горечавка фиолетовая и
кристаллический фиолетовый в низких концентрациях подавляют рост
грамположительных бактерий, но мало влияют на грамотрицательные
бактерии. Установлено, что ингибирующее действие кристаллического
фиолетового на золотистый стафилококк оказывает на синтез клеточной
стенки. Такие красители, как акрифлавин и профлавин, подавляют действие
грамотрицательных бактерий, но мало влияют на грамположительные
бактерии. Практическое применение этих красителей производится при
получении чистых культур и при лечении инфекционных процессов.
Ингибирующее действие кристаллического фиолетового на бактерии
можно продемонстрировать в лабораторных условиях путем выращивания
грамположительной бактерии (Corynebacterium) и грамотрицательной
бактерии (Xanthomonas) на питательной агаровой среде с добавлением
кристаллического фиолетового.
Необходимый материал
Бульонные культуры Ксантомонад и коринебактерий, питательная
агаровая среда, кристаллическая фиолетовая питательная агаровая среда,
стерильные пластины Петри, прививочная петля, Бунзеновская
горелка/спиртовая лампа, восковой маркировочный карандаш.
Методика
Разделите дно пластины Петри на два сектора с помощью воскового
маркировочного карандаша. Обозначьте два сектора каждой пластины для двух
организмов, которые будут привиты. Растопите кристаллический фиолетовый
115
питательный агар и питательную агаровую среду, дайте им остыть до 50°C и
разлейте в отдельные стерильные пластины Петри.
Инокулят Ксантомонас и коринебактерии в соответствующие меченые
сектора кристаллического фиолетово–питательного агара и пластин
питательного агара полосчатой инокуляцией. Инкубируйте пластины при
температуре 30°С в течение 24-48 часов в перевернутом положении.
Наблюдайте за инокулированными пластинками для роста тест–
организмов как на питательном агаре, так и на кристаллически-фиолетовых
питательных пластинках агара.
Рост Ксантомонад будет наблюдаться только в кристаллической
фиолетовой питательной агаровой пластинке, в то время как рост
коринебактерий на этой пластинке не будет наблюдаться, что указывает на
бактериостатическую активность кристаллического фиолетового на
грамположительную бактерию. Обе бактерии будут расти на питательной
агаровой среде, куда был добавлен Нодье.
16.8. Влияние различных длин волн роста бактерий лайтона
Фотосинтез-это процесс, посредством которого растения и некоторые
бактерии (прототрофы) преобразуют лучистую энергию в виде света в
метаболическую энергию и восстановительную энергию. Считается, что те
организмы (растения, водоросли и цианобактерии), которые используют воду,
осуществляют кислородный или растительный фотосинтез, а другие
(фиолетовые и зеленые бактерии), которые используют другие источники
электронов, осуществляют кислородный или бактериальный фотосинтез.
Фотоавтотрофные микроорганизмы получают свою энергию путем
преобразования видимого света, лучистой энергии, в химическую энергию. Эта
реакция катализируется классом молекул, называемых хлорофиллами,
представители которых содержатся почти во всех прототрофах, использующих
энергию света для расщепления неорганических молекул с получением
водорода для восстановления углекислого газа. Это приводит к образованию
богатых энергией органических соединений.
116
Видимый свет может быть разделен на несколько различных цветов
(например, фиолетово-синий, зеленый, желтый, оранжевый, красный) в
диапазоне длин волн от 422 до 760 Нм. Фотосинтез не использует все части
видимого спектра с одинаковой эффективностью. Область пикового
поглощения в более длинных длинах волн изменяется в зависимости от
конкретных видов хлорофилла и белков, с которыми они связаны. У зеленых
микроорганизмов наибольшая эффективность наблюдается в фиолетово-синей
части, а минимальная - в зелено-желтой части видимого спектра.
Влияние различных длин волн света на рост бактерий в лабораторных
условиях можно изучить, используя цветные целлулоидные фильтры для
воздействия на бактерии в различных областях видимого спектра.
Необходимый Материал
Культура исследуемой бактерии, стерильные скосы питательных
агаровых сред, целлулоидные фильтры различных цветов (синий, зеленый,
желтый, оранжевый, красный и бесцветный), небольшие открытые картонные
коробки (6), инокуляционная петля, Бунзеновская горелка.
Методика
Асептически инокулируйте каждую пластинку тестируемой
бактериальной культурой методом штриховки. Поместите по одной
инокулированной культуральной пластинке в каждую коробку и накройте
верхушки всех шести отдельными целлулоидными фильтрами.
Выставляйте ящики на свет в течение трех дней при нормальной системе
освещения.
Наблюдайте за всеми шестью пластинами, подвергнутыми воздействию
различных цветов для роста бактериальных культур. Укажите степень роста,
используя следующие символы: 0 для отсутствия роста, + для незначительного
роста, 2+ для умеренного роста, 3+ для обильного роста. Наблюдайте за
изменениями в характере роста бактерий и окраске бактериальной культуры.
Из полученных результатов Определите диапазоны длин волн света,
наиболее подходящие для роста и размножения бактерий.
117
16.9. Смертельное воздействие ультрафиолетового излучения (уф-лучей)
на рост бактерий
Различные участки светового спектра оказывают различное воздействие
на микробы. Излучение отличается длиной волны и энергией. Более короткие
длины волн ниже 300 Нм, такие как ультрафиолетовое (электромагнитное
излучение), рентгеновское, гамма-лучи и космические лучи (называемые
ионизирующими излучениями), обладают большей энергией и являются
микробицидными по своей природе. Их основной эффект заключается в
ионизации воды до высоко свободных радикалов, которые могут разрушать
молекулы ДНК. Рентгеновские и гамма-лучи, из-за их высокого содержания
энергии и способности проникать в вещество, используются в качестве средств
стерилизации, особенно для термолабильных материалов. Излучение кобальта
обычно используется для изменения ДНК злокачественных клеток в попытке
остановить их неконтролируемое размножение, поскольку излучение изменяет
ген, который контролирует скорость размножения клеток.
Ультрафиолет означает выход за пределы фиолетового в
электромагнитном спектре, что соответствует свету с длиной волны менее 4000
Å (или 400 Нм). Ультрафиолетовый свет производит смертельный эффект в
клетках, подвергнутых воздействию длин волн в диапазоне 210-300 Нм,
причем 265 Нм являются наиболее смертоносными. Он индуцирует
пиримидиновые диммеры в ДНК, что приводит к искажению молекул ДНК,
вмешивается в репликацию и транскрипцию молекул ДНК во время синтеза
белка и вызывает мутации. Если мутация происходит в критических генах,
гибель клетки приводит к тому, что повреждение не восстанавливается.
Ультрафиолетовые лампы используются для стерилизации некоторых
теплолюбивых растворов и уменьшения количества микроорганизмов в
больничных операционных, прививочных камерах и шкафчиках для хранения
мяса. На действие излучения влияют многие переменные, например, возраст
клеток, состав среды, температура, расстояние и время воздействия. Ртутные
118
лампы низкого давления, имеющие высокую мощность (90%) 2537 Å (253,7
Нм), являются очень эффективными бактерицидными лампами.
Это упражнение имеет дело с тестированием воздействия
ультрафиолетовых лучей (254 нм), чтобы определить минимальное количество
воздействия, необходимое для 100-процентного уничтожения организма.
Необходимый материал
Питательные бульонные культуры исследуемых бактерий, стерильные
питательные агаровые пластины, ультрафиолетовая лампа (254 Нм),
Бунзеновская горелка, стерильные серологические пипетки по 1 мл, восковой
маркировочный карандаш, стеклянные разбрасыватели.
Методика
Возьмите пять пластин питательного агара и маркируйте крышки тесторганизмами, подлежащими инокуляции, со временем воздействия
ультрафиолетового света как 0 (необработанный контроль) и 1, 2, 4, 6, 8, и 10
минут (с крышкой или с крышкой). Инокулят все меченые пластинки
соответствующей бактерией, заливая 0,1 мл клеточной суспензии из исходных
культур, и распределяют инокуляты с помощью стерильных стеклянных
разбрасывателей, отдельных для каждого организма. Подвергните все
инокулированные пластины (кроме контрольных) воздействию
ультрафиолетового источника света в соответствии с графиком времени (т. е.,
1, 2, 4, 6, 8, и 10 минут) и условия (с крышкой и без крышки как) путем
размещения их на расстоянии 30 см от источника УФ-излучения. Начните
отсчет времени, когда вы включите УФ - лампу. Замените крышки.
Инкубируют все пластины (экспонированные и неэкспонированные) при 25°С
в течение 2-5 дней в перевернутом положении.
Наблюдайте за всеми питательными агаровыми культурами для роста
бактериальных видов, подвергнутых воздействию в течение различных
периодов времени. Запишите степень роста в табличной форме, используя
следующие символы: 0 для отсутствия роста, + для незначительного роста, 2+
для умеренного роста и 3+ для обильного роста. Из полученных результатов
119
выясняют эффективность уничтожения УФ-лучей во время воздействия
исследуемой бактерии и действие УФ-лучей при их прохождении через стекло.
Особенности
Не смотрите на лучи, исходящие от ультрафиолетовой лампы, потому что
лучи могут вызвать катаракту и другие травмы глаз. Ультрафиолетовая лампа
должна быть помещена выше 30 см от культуры, которую вы хотите облучить.
Культура, подлежащая облучению, должна находиться на прямом пути
излучения. Избегайте копания в среде с вашей петлей, оставляя полосы на
поверхности пластины питательного агара.
16.10. Влияние относительной влажности воздуха на рост бактерий
Вода необходима для роста всех микроорганизмов. Некоторые
микроорганизмы менее чувствительны к относительной влажности (то есть к
количеству водяного пара в воздухе, выраженному в процентах от
максимального количества, которое воздух мог бы удерживать при данной
температуре) и могут выживать при ее отсутствии и возобновлять рост при
наступлении благоприятных условий. Другие более чувствительны и вскоре
умирают в сухой атмосфере.
Размножение бактериальных патогенов растений, инициация болезни и
развитие симптомов более интенсивны во влажных условиях по сравнению с
сухими условиями. Поэтому изучение влияния относительной влажности
воздуха на бактериальный патоген растений имеет важное значение.
Необходимый материал
Растения опрыскивают бактериальными патогенами растений,
инкубационными камерами с различной влажностью, гигрометром,
питательными агаровыми пластинами и т. д.
Методика
120
Опрыскайте растения-хозяева бактериальным патогеном растений и
держите каждое растение отдельно в отдельных инкубационных камерах с
различной относительной влажностью в диапазоне от 40 до 90 процентов.
Инкубируйте растения в течение трех дней в соответствующих камерах.
Сорвите опрысканные бактериями листья привитых растений и асептически
прижмите их к пластинам питательного агара, чтобы получить отпечатки.
Маркируйте отпечатанные пластины в соответствии с соответствующей
влажностью и инкубируйте пластины в инкубаторе BOD при температуре
28°C.
Наблюдайте за развитием/неразвитием бактериальных колоний
исследуемой бактерии в каждой пластинке и соотносите их с влажностью,
доступной во время роста бактерии во влажностной камере.
Аналогично подсчитайте бактериальную популяцию в каждой
пластинке, чтобы оценить влияние относительной влажности на рост и
размножение бактерий.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]