Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
91
среды. Во время спорообразования вегетативная клетка дает начало новой
внутриклеточной структуре, называемой эндоспорой, которая окружена
непроницаемыми слоями, называемыми споровыми оболочками.
Для полного превращения вегетативной клетки в спорангий, а затем в
спору у большинства спорообразующих видов требуется 6-8 часов. Эндоспора
развивается в характерном положении внутри клетки, то есть в Центральном,
субтерминальном или терминальном. Как только эндоспора образуется в
клетке, клеточная стенка распадается, высвобождая эндоспору, которая позже
становится независимой спорой. Эндоспоры могут оставаться в состоянии
покоя в течение длительного периода времени. Одна запись описывает
выделение жизнеспособных спор из 3000-летнего археологического образца.
Однако свободная спора может вернуться в свое вегетативное или растущее
состояние с возвращением благоприятных условий.
Растительные патогенные бактерии не образуют эндоспор. Эндоспоры
образуются представителями семи родов, например, Bacillus, Clostridium,
Coxiella, Desulfotomaculum, Sporolactobacillus, Sporomusa и Thermoactinomyces.
К ним относятся непатогенные почвенные обитатели (Bacillus и Clostridium) и
патогенные (Clostridium tetani, C. Perfingens, C. Botulinum и Bacillus anthracis,
возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма и сибирской язвы
соответственно).
Споры окрашиваются дифференцированно с помощью специальных
процедур, которые помогают красителям проникать через стенку спор. Водное
первичное окрашивание (малахитовый зеленый) наносится и пропаривается
для усиления проникновения непроницаемых споровых оболочек. После
окрашивания эндоспоры не так легко обесцвечиваются и становятся зелеными
внутри красных клеток.
Необходимый материал
Сорок восемь часов питательных агаровых культур исследуемых
бактерий, малахитовый зеленый (5% водный раствор), сафранин (0,5% водный
92
раствор), окрашивающий лоток, стеклянные предметные стекла, прививочная
петля, промокательная бумага, спиртовая лампа, микроскоп.
Методика
Сделайте мазки исследуемой бактерии на отдельных чистых предметных
стеклах. Воздух сухой и тепло фиксируют мазки. Залейте мазки малахитовой
зеленью. Нагрейте слайды до кипения и отпаривайте в течение 5 минут, время
от времени добавляя больше пятен к мазку. Промойте горки под медленно
текущей водопроводной водой. Контрасьте сафранином в течение 30 секунд.
Промыть мазок дистиллированной водой. Промокните сухие слайды
абсорбирующей/промокательной бумагой.
Исследуйте предметное стекло микроскопически под масляноиммерсионными объективами. У бацилл эндоспоры окрашиваются в зеленый
цвет, а вегетативные клетки-в красный. Обратите внимание на положение
споры, то есть на Центральное, субтерминальное или конечное. Положение
спор полезно для идентификации видов в Bacillus.
13.9. Окрашивание капсул
Некоторые бактериальные клетки окружены слизистым веществом,
образующим вязкую оболочку вокруг клетки. Эта структура называется
капсулой, когда она имеет круглую и овальную форму и прочно связана с
бактерией, тогда как она называется слоем слизи, когда она имеет
неправильную форму и слабо связана с бактерией.
Капсула, которая находится снаружи клетки, также частично
синтезируется в цитоплазме и обычно состоит из полисахаридов, но может
содержать и другие материалы; например, Bacillus anthracis имеет капсулу из
Поли-D-глутаминовой кислоты. Способность бактерии образовывать капсулу
определяется генетически. Капсула хорошо развита у некоторых бактерий,
таких как Streptococcus pneumonia, Clostridium perfringens и Klebsiella
pneumonia, в то время как у других бактерий она нечеткая. У некоторых
бактерий (например, Beijerinckia) капсула может содержать более одной
93
клетки. Диагностике пневмонии и других заболеваний помогает окрашивание
капсул.
Капсулы помогают бактериям противостоять фагоцитозу
фагоцитарными клетками. Кроме того, капсулы содержат большое количество
воды и могут защитить бактерии от высыхания. Они исключают
бактериальные вирусы и большинство гидрофобных токсичных материалов,
таких как моющие средства.
Капсулы специфических патогенов могут быть эффективно перемещены
(например, при пневмококковом, гемофильном гриппе и менингококковом
гриппе) с помощью антисыворотки, специфичной для типа капсулы, и это
может обеспечить предположительную идентификацию бактерии. Капсулы
хорошо видны в световом микроскопе, когда используются отрицательные
пятна и специальные пятна капсул.
1. Капсулы окрашивания, негативного техника окрашивания
При отрицательном окрашивании фон, но не бактерия, окрашивается
кислотным пятном тушью или нигрозином. Пятно легко отдает ион водорода,
и хромофор красителя становится отрицательно измененным. Поскольку
поверхность большинства клеток бактерий заряжена отрицательно,
поверхность клеток отталкивает пятно. При отрицательном окрашивании
бактериальный рост смешивают с петлей пятна (индийской тушью или водным
нигрозином) на чистом предметном стекле и накладывают на него покровный
листок. Капсула выглядит как четкая зона между клеточной стенкой и темным
фоном под высоким сухим и масляным погружным объективом.
Необходимый материал
36-48 - часовая Молочная культура тестируемой бактерии, чернила
нигрозин/Индия, абсорбирующая бумага, чистые предметные стекла (2),
стеклянные покровные листы, прививочная петля, горелка Бунзена.
Методика
Возьмите чистую стеклянную горку. Поместите каплю нигрозина или
индийской краски близко к одному концу чистого стеклянного предметного
94
стекла. Добавьте две горсти бульонной культуры в каплю пятна и смешайте с
петлей. Приготовьте мазок взвешенного организма с помощью края второго
предметного стекла, удерживаемого под углом 30° и отодвигаемого на другой
конец предметного стекла. Высушите мазок на воздухе.
Осмотрите предметное стекло под масляно-иммерсионным объективом.
Капсулированные бактерии будут выглядеть как четкие зоны между клеточной
стенкой и темным фоном.
2. окрашивание капсул методом окрашивания Энтони
В 1931 году Э. Э. Энтони разработал простой метод окрашивания капсул
у бактерий. В этом методе два пятна, а именно. используются кристаллический
фиолетовый и медный купорос. В качестве основного красителя используется
кристаллический фиолетовый (1% водный раствор). При нанесении
кристаллического фиолетового, как капсулярный материал, так и клеточная
стенка примет цвет пятна и будет казаться темно-синим цветом. Но капсула,
будучи неионной, не будет поглощать первичное пятно. Медный купорос,
который действует и как обесцвечивающее средство, и как
противоокрашивающее средство, при нанесении удаляет избыточное
первичное пятно и придает цвет обесцвеченному капсульному материалу.
Капсула, наконец, кажется светло-голубой в отличие от темно-фиолетового
цвета клетки.
Необходимый материал
36-48 - часовая Молочная культура исследуемой бактерии, кристальнофиолетовый водный раствор (1% w/v), медный купорос (20%), инокуляционная
петля, стеклянные предметные стекла (2), промокательная бумага.
Методика
Возьмите чистую стеклянную горку. Положите петлю бактериальной
культуры на один конец слайда. Приготовьте тяжелый мазок бактерии.
Добавьте кристаллический фиолетовый и дайте мазку вступить в реакцию с
кристаллическим фиолетовым в течение 2 минут. Смойте краситель 20 -
95
процентным медным купоросом. Слейте медный купорос. Аккуратно
промокните-высушите предметное стекло.
Осмотрите предметные стекла под масляно-иммерсионным объективом.
У капсулированных бактерий вегетативные клетки темно-фиолетового цвета,
окруженные светло-голубыми капсулами. У некапсулированных бактерий
таких различий не наблюдается.
Особенности
Всегда готовьте тяжелый мазок организма, так как некоторые клетки
будут соскальзывать с горки во время мытья. Никогда не нагревайте
фиксирующие мазки, так как нагревание приводит к усадке, которая может
создать четкую зону вокруг клетки, которая является артефактом и которую
можно ошибочно принять за капсулу. Следует избегать смывания мазка водой,
так как капсульные материалы растворимы в воде и могут быть вытеснены и
удалены при интенсивной промывке.
13.10. Окрашивание жгутиков
Многие бактерии подвижны из-за наличия одного или нескольких очень
тонких нитевидных, нитевидных придатков, называемых жгутиками. Это
тонкие белковые структуры, которые возникают в цитоплазме и выступают из
клеточной стенки.
Бактерии демонстрируют четыре типа бичевания: 1) монотонные,
имеющие один жгутик на одном конце (или полюсе) клетки; 2) лофотричные,
имеющие много жгутиков в пучках или скоплениях на одном конце; 3)
амфитричные, имеющие жгутики на обоих концах, либо поодиночке, либо в
пучках; и 4) перитричные, имеющие жгутики по всей поверхности. Если
жгутики присутствуют на концах (либо на одном, либо на обоих) клетки, они
называются полярными жгутиками. Присутствие, расположение и количество
бактерий являются одними из важных критериев, используемых при
идентификации и классификации бактерий. Для того, чтобы увидеть их в
световой микроскоп, они должны быть сгущены сначала с помощью
96
химических веществ, известных как протравитель, а затем окрашены
красителем.
Необходимый материал
18-часовая питательная агаровая культура исследуемой бактерии,
жгутиковый протравитель (то есть Карболфуксин Циля), специально
очищенные стеклянные предметные стекла, 1 мл дистиллированной воды,
раствор дихромата, 95-процентный спирт, промывочная бутылка,
инокуляционная петля, горелка Бунзена, микроскоп.
Методика
Подготовка обезжиренных слайдов: возьмите новые слайды, окуните их
в раствор дихромата, промойте водой, промойте в 95-процентном спирте,
вытрите насухо сырной тканью и пропустите слайд через пламя Бунзеновской
горелки. Дайте слайдам остыть.
Приготовление мазка: сделать суспензию бактерии в дистиллированной
воде. Инкубируйте суспензию при комнатной температуре в течение 10-15
минут. Поместите одну петлю подвески к одному концу свободного от жира
скольжения.
Наклоните предметное стекло под углом 30°, чтобы капля растеклась и
образовала на нем тонкую пленку. Дайте пленке высохнуть на воздухе при
комнатной температуре. Накройте горку жгутиковой протравой на 10 минут.
Аккуратно промойте дистиллированной водой. Залейте горку карболфуксином на 5 минут. Аккуратно промойте предметное стекло
дистиллированной водой. Высушите слайд на воздухе.
Исследуйте предметное стекло микроскопически под масляноиммерсионным объективом. Запишите количество жгутиков и различные
комбинации жгутиков. Клетки выглядят как розовые, прямые стержни,
окруженные густо окрашенной внешней оболочкой, которая несет розовые
жгутики. Эти жгутики представляют собой тонкие волнистые нити большей
длины, чем клетки. Они могут быть peritrichous (т. е. бактерий Erwinia),
lophotrichous (в псевдомонады), или monotrictium (в Хапог).
97
Исследуйте препарат с помощью масляно-иммерсионного объектива.
Ядерные тела, по одному или два в каждой клетке, окрашиваются в
фиолетовый цвет, окруженный бесцветной зоной цитоплазмы. Клеточная
мембрана выглядит как слегка пурпурный слой.
Особенности
Всегда используйте специально очищенные, обезжиренные слайды. Не
нагревайте фиксирующие мазки. Не промокайте сухие салфетки. Всегда
используйте уменьшенное освещение микроскопа, чтобы ясно видеть жгутики.
13.12. Окрашивание жизнеспособности бактерий
Различие между живыми и мертвыми клетками в культуре
осуществляется методом окрашивания жизнеспособности. Этот метод основан
на том, что в мертвых клетках происходят определенные изменения, которые
приводят к тому, что эти клетки дают другую реакцию на пятна, чем живые
клетки.
Необходимый материал
Двух-трехнедельная культура бацилл, раствор метиленового синего
Леффлера, разбавленный раствор карболфуксина, предметное стекло,
Бунзеновская горелка, промокательная бумага, микроскоп.
Методика
Приготовьте мазок культуры. Жаром зафиксируйте мазок. Залейте мазок
метиленовым синим на 10 минут. Тщательно промойте мазок водопроводной
водой, пока он не станет бледно-голубым. Запустите карбол фуксин вниз по
горке на очень короткое время. Немедленно промойте водой из-под крана.
Промокните сухой мазок.
Исследуйте мазок под микроскопом. Живые бактерии кажутся
фиолетовыми, а мертвые-красными или розовыми. Живые споры
окрашиваются в бледно-розовый цвет, а мертвые-в синий.
13.13. Реакция суслова для определения грамположительных и
грамотрицательные бактерии
Необходимый Материал
98
Исследуемая бактериальная культура, 3-процентный раствор Кон,
предметное стекло, игла с прожилками.
Методика
Поместите две капли 3-процентного раствора KoH на предметное стекло.
Возьмите петлю тестовой бактериальной культуры с помощью прививочной
иглы. Поместите культуру в каплю KoH и перемешивайте по часовой стрелке
до тех пор, пока культура не будет распределена в растворе KoH или не
образуется слизистая суспензия. Поднимите прививочную иглу вместе со
слизистым материалом, чтобы отметить реакцию.
Если культура образует слизистый материал и образует нитку при
поднятии прививочной иглы, то это культура грамотрицательных бактерий.
Если культура помещается в раствор Кон и не образует струны при подъеме
иглы, то это обозначает культуру грамположительных бактерий.
99
14. ПОДВИЖНОСТИ БАКТЕРИЙ
Бактерии могут иметь или не иметь подвижных придатков, то есть
жгутиков для их движения. Движение бактерий с помощью их жгутиков
называется истинной подвижностью. Некоторые бактерии без жгутиков имеют
скользящее движение. Иногда движение бактерий можно ошибочно принять за
броуновское движение.
Растительные патогенные бактерии имеют придатки жгутиков, которые
помогают им перемещаться в тонкой пленке воды на поверхности планеты,
чтобы достичь точки входа, чтобы вызвать инфекцию.
Для демонстрации подвижности бактерий за счет наличия жгутиков
используется техника висячих капель.
14.1. Техника висячего падения для демонстрации подвижности бактерий
Препарат висячих капель полезен для микроскопического исследования
живых бактерий, не окрашивая их, а также для определения их подвижности за
счет жгутиков.
Необходимый Материал
Двенадцатичасовая бульонная культура Erwinia spp., висячая капля
(полость) слайда, покровные листы, вазелин/вазелин, спички, восковой
маркировочный карандаш.
Методика
Очистите и сожгите предметное стекло висячей капли и поместите его на
стол с углублением сверху. Распределите немного вазелина или вазелина
вокруг полости предметного стекла. Очистите накладку и нанесите вазелин на
каждый из четырех углов накладки, используя спичку. Положите обложку на
чистую бумагу вазелином вверх.
Перенесите одну петлю культуры в центр обложки слипа. Поместите
впадину скольжения на крышку скольжения так, чтобы полость была обращена
вниз подвески. Осторожно нажмите на ползунок, чтобы сформировать
уплотнение между накладкой крышки и ползуном. Поднимите препарат и
100
быстро поверните висячую каплю препарата с крышкой скольжения вверх так,
чтобы капля культуры была подвешена. Исследуйте препарат под
маломощным объективом с уменьшенным освещением.
Обратите внимание на размер, форму и характеристики подвижности
бактерий (то есть, истинная ли подвижность или броуновское движение;
вибрационное или танцевальное движение бактерий в суспензии из-за
бомбардировки молекулами воды). При истинной подвижности наблюдается
перемещение бактерий из одного места в другое.
14.2. Броуновское движение
Случайное движение микроскопических частиц, взвешенных в жидкости
или газе, вызванное столкновениями с молекулами окружающей среды,
известно как броуновское движение.
Его не следует путать с движением бактерий в суспензии.
Необходимый материал
Сульфат цинка, дистиллированная вода, предметное стекло, микроскоп.
Методика
Приготовьте суспензию сульфата цинка в дистиллированной воде.
Положите каплю на предметное стекло, накройте крышкой и наблюдайте в
микроскоп.
Случайное движение частиц можно наблюдать под микроскопом в
фиксированном месте, в то время как в случае бактериального движения
движение можно наблюдать в микроскопическом поле от одного места к
другому.
14.3. Связь вирулентности с подвижностью (у Erwinia carotovora var. Zeae)
Методика
Прививают Erwinia carotovora var. зеаэ путем вколачивания петли
инокулята в среду вертикально в пластину Петри и инкубации при температуре
25°С.
Вирулентные изоляты Erwinia carotovora var. zeae распространяются
горизонтально на большее расстояние от точки конюшни с обеих сторон в
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]