Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
131
Методика
Приготовьте обезжиренный молочный агар из следующих компонентов
(на литр среды): сухое обезжиренное молоко-100,0 г; пептон-5,0 г; агар-15,0 г;
рН-7,2. разлейте автоклавированную и охлажденную (45-50°С) среду в
стерильные чашки Петри (по 20 мл каждая) и дайте застыть. Наклейте этикетку
на пластинки из обезжиренного молочного агара с названием бактериального
организма, подлежащего инокуляции, и сохраните неокрашенную пластинку в
качестве контрольной. Сделайте одну линию штриховки инокуляции из
каждой культуры в ее маркированную пластину Петри по всей поверхности
среды. Инкубируют пластины (инокулированные и неокулированные) в
течение 24-48 часов при температуре 28°С в перевернутом положении.
Наблюдайте за всеми привитыми пластинками для любой зоны очистки вокруг
линии роста.
Четкая зона, окружающая рост бактерий, является положительной
реакцией на внеклеточную секрецию казеиназы, в то время как отсутствие
четкой зоны вокруг роста организма является отрицательной реакцией.
17.6. Уреазный тест
Мочевина является основным органическим отходом белкового
пищеварения у большинства позвоночных животных и выводится с мочой.
Некоторые микроорганизмы обладают способностью продуцировать фермент
уреазу. Уреаза-это гидролитический фермент, который атакует связь углерода
и азота в амидных соединениях (например, мочевина) с выделением аммиака.
Это полезный диагностический тест для идентификации бактерий, особенно
для того, чтобы отличать представителей рода от грамотрицательных
патогенов.
Уреазный тест проводят путем выращивания тест-организмов на
мочевиновом бульоне или агаровой среде, содержащей индикатор рН фенол
красный (рН 6,8). Во время инкубации микроорганизмы, обладающие уреазой,
будут производить аммиак, который повышает рН среды/бульона. По мере того
132
как рН становится выше, фенольный красный цвет меняется с желтого цвета
(рН 6,8) на красный или темно-розовый (вишневый) цвет. Неудача развития
темно-розового цвета из-за отсутствия производства аммиака свидетельствует
об отсутствии продукции уреазы микроорганизмами.
Необходимый материал
Культуры тест-бактерий, мочевино-агаровая среда/мочевино-бульонные
пробирки, инокуляционная петля, Бунзеновская горелка, восковой
маркировочный карандаш.
Методика
Приготовьте мочевино-агаровую среду из следующих компонентов (на
литр): пептон-1,0 г; хлорид натрия-5,0 г; моногидрофосфат калия (или
дигидрофосфат) - 2,0 г; агар-20,0 г; дистиллированная вода-1000 мл
(растворяют ингредиенты нагреванием, доводят рН до 6,8 и автоклавируют при
температуре 121°С в течение 15 мин и охлаждают до 50°с); глюкоза-1,0 г;
фенол красный (0,2% раствор) - 6,0 мл (добавляют в расплавленную основу и
парят в течение 1 часа, охлаждают до 50°с).); мочевина, 20-процентный водный
раствор 100,0 мл (стерилизуют фильтрованием и добавляют асептически в
базальную среду). Хорошо перемешайте и распределите по стерильным
емкостям, то есть колбам и культуральным пробиркам, и дайте среде
затвердеть в наклонном положении, чтобы образовались наклоны. Маркируйте
пробирки с мочевинной агаровой средой/пробирки с мочевинным бульоном
названием бактериального организма, подлежащего инокуляции. Инокулят
мочевинный агар наклонно/бульон с исследуемой бактерией. Инкубировать
инокулированные скосы/бульоны в течение 24-48 часов при температуре 37°C.
Исследуйте скосы/бульоны на предмет их цвета (наличие уреазы дает
красный или вишневый цвет, в то время как уреаза обозначается желтым
цветом).
Особенности
133
Мочевину никогда не следует стерилизовать в автоклаве вместе с
другими компонентами, так как она нестабильна и разрушается при давлении
пара 15 фунтов на квадратный дюйм.
17.7. Испытание на получение сероводорода
Сероводород (H2S), широко известный как газ “тухлого яйца”, выделяет
обильное количество газа (когда яйца разлагаются некоторыми бактериями,
такими как Proteus vulgaris) путем восстановительного гидрирования
серосодержащих аминокислот (например, цистина, цистеина и метионина) или
путем восстановления неорганических соединений серы, таких как
тиосульфаты (S2O32−), сульфаты (SO4 2−) или сульфиты (SO3 2−).
Образование сероводорода может быть обнаружено путем включения
соли тяжелого металла, содержащей ион (Fe2+) или свинец (Pb2+) в качестве
индикатора H2S, в питательную питательную среду, содержащую цистеин и
тиосульфат натрия в качестве субстратов серы. При получении сероводород,
бесцветный газ, вступает в реакцию с солью металла (сульфатом железа),
образуя видимые нерастворимые осадки черного сульфида железа.
Необходимый материал
Питательный агар наклонные культуры тест-бактерий и Pseudomonas, SI
(сульфидно-индольная подвижность) агаровые пробирки, инокулирующая
игла (петля), Бунзеновская горелка, восковой маркировочный карандаш.
Методика
Приготовьте сим-агаровую среду из следующих компонентов (на литр):
пептон-30,0 г; говяжий экстракт-3,0 г; сульфат железа аммония - 0,2 г;
тиосульфат натрия-0,025 г; агар-3,0 г; дистиллированная вода-1000,0 мл.
Маркируйте сим агаром глубокие пробирки с названием организма,
подлежащего инокуляции. Инокулируйте исследуемый организм в
соответствующим образом маркированную пробирку с помощью колоторезаной инокуляции. Инкубируйте инокулированные пробирки при
температуре 28°C в течение 48 часов. Исследуйте пробирки на наличие или
отсутствие черной окраски по линии колото-резаных прививок.
134
Почернение питательной среды является положительным тестом на
образование H2S. Этот черный цвет обусловлен образованием H2S из
ингредиента среды (т. е. тиосульфата натрия), который затем соединяется с
другим ингредиентом среды (сульфатом железистого аммония), в результате
чего образуется черное нерастворимое соединение-сульфит железа.
17.8. Катаболизм углеводов микроорганизмами (окисление и ферментация
глюкозы)
Углеводы-это органические молекулы, которые содержат углерод,
водород и кислород в соотношении (CH2O) n. Они бывают трех типов,
например, моносахариды (простые сахара, содержащие от трех до семи атомов
углерода), дисахариды (состоящие из двух молекул моносахаридов) и
полисахариды (содержащие восемь или более молекул моносахаридов).
Химические реакции, высвобождающие энергию при разложении сложных
органических молекул, называются катаболизмом. Способностью расщеплять
углеводы обладает большое количество микробов. Эта микробная активность
имеет большое значение в круговороте углерода в природе и в
промышленности. Организмы используют углеводы по-разному в зависимости
от их ферментативного комплемента. Характер ферментации характерен для
определенных видов, родов или групп организмов, и по этой причине это
свойство широко используется в качестве метода биохимической
дифференциации микробов.
Межклеточные ферменты используются клеткой для метаболического
расщепления углеводов. Два примера таких ферментов-мальтаза и лактаза.
Фермент мальтаза воздействует на мальтозу с образованием двух молекул
глюкозы, в то время как лактаза разлагает лактозу и производит одну молекулу
глюкозы и одну галактозу. Все конечные продукты этих реакций используются
в гликолизе.
Глюкоза, попав в клетку, может катаболизироваться либо аэробно
(биоокисление, при котором молекулярный кислород (O2) может служить
конечным акцептором электронов, т. е. окислительный метаболизм), либо
135
анаэробно (биоокисление, при котором неорганические ионы, отличные от
кислорода, например NO−3 или SO42, могут служить конечным акцептором
электронов, т. е. ферментативный метаболизм), либо как аэробными, так и
анаэробными путями, и некоторые организмы не способны окислять глюкозу
ни тем, ни другим. Конечными продуктами метаболизма углеводного
брожения могут быть либо органические кислоты (например, молочная,
муравьиная или уксусная), либо органические кислоты и газы (например,
водород или углекислый газ).
Микроорганизмы, которым требуется органический углерод, могут
связываться в качестве источника энергии и называются хемоорганотрофными.
Является ли организм окислительным или ферментативным, можно
определить, используя среду Хью и Лейфсона (среды), триптон и
бромтимоловый синий (индикатор). Используются две трубки, одна открыта
для воздуха, а другая запечатана парафином (чтобы не пропускать воздух).
Рост микроорганизмов в этой среде происходит либо за счет использования
триптона, что приводит к щелочной реакции (темно-синий цвет), либо за счет
использования глюкозы, что приводит к образованию кислоты (превращение
синего бромтимола в желтый). Микроорганизмы, продуцирующие кислоту как
в закрытых, так и в открытых пробирках, называются ферментативными, а
микроорганизмы, продуцирующие кислоту только в открытых пробирках, окислительными.
Необходимый материал
Бульонные культуры исследуемого возбудителя, средние пробирки,
каждая из которых содержит по 5 мл среды, стерильный жидкий парафин (или
минеральное масло), стерильный 10-процентный раствор глюкозы,
инокуляционная игла, Бунзеновская горелка.
Методика
Готовят глюкозо–агаровую среду следующего состава: пептон-2,0 г;
хлорид натрия-5,0 г; дикалийводородфосфат-0,3 г; раствор бромтимолового
136
синего-15,0 мл; агар-3,0 г; дистиллированная вода-1000,0 мл. (Растворите
взвешенные компоненты, доведите объем до 1000, отрегулируйте рН до 7,1 и
добавьте бромтимол. Разлить базальную среду в пробирки и колбы;
стерилизовать автоклавированием при 121°С в течение 15 минут;
расплавленную среду взять в пробирки и добавить 1 мл стерильного раствора
глюкозы [10%] до получения конечной концентрации 1%). Разрешить трубы,
чтобы охладить. Маркируйте каждую из средних пробирок названием
тестируемого организма (по две пробирки на организм), подлежащего
инокуляции.
Инокулят две пробирки глюкозной среды с тестируемой бактерией путем
протыкания прямой проволокой. В качестве контроля можно использовать две
неинвазивные трубки. Налейте жидкий парафин поверх среды, чтобы
сформировать слой около 1 см в глубину в одну из трубок каждой пары.
Инкубируйте пробирки при температуре 28°C в течение 24-48 часов.
Понаблюдайте за пробирками и запишите наличие роста бактерий и цвет
среды, а также запишите тип обмена веществ. Бактерия, которая действует на
глюкозу и производит кислоту, в свою очередь меняет синий цвет индикатора
на желтый и, таким образом, ферментативна в реакции. Бактерия, лишенная
способности атаковать глюкозу, но атакующая триптон, который, в свою
очередь, производит темно-синий цвет, то есть щелочную реакцию, является,
таким образом, окислительной реакцией.
Особенности
Глюкозу никогда не следует автоклавировать вместе с другими
компонентами среды. В инокулированные пробирки следует добавить
достаточное количество жидкого парафина, чтобы образовался слой глубиной
около 1 см для создания анаэробных условий.
17.8.1. Группировка бактериальных изолятов Xanthomonas malvacearum
на основе утилизации лактозы
Вариации в утилизации лактозы наблюдаются у изолятов Xanthomonas
malvacearum. Некоторые изоляты используют лактозу в качестве источника
137
сахара или углеводов, в то время как другие изоляты того же патогена этого не
делают. На основе утилизации лактозы изоляты могут быть сгруппированы как
Lac + или Lac −.
Методика
Приготовьте базальную среду для Ксантомонад (краситель, 1962):
NH4H2PO4, 0,5 г; K2HPO4, 0,5 г; MgSO4 7H2O, 0,2 г; NaCl, 5,0 г; дрожжевой
экстракт, 1,0 г; агар–агар, 20 г; H2O, 1 л; и добавьте углеродное соединение
(лактозу), чтобы получить 1-процентную концентрацию. Добавьте в эту среду
0,7 мл бромокрезола пурпурного (5-процентного спиртового раствора).
Отрегулируйте рН до 6,8 и стерилизуйте среду паром в течение 30 минут в
течение трех последовательных дней. Полосуют 48-часовые молодые растущие
культуры тест-изолятов на среде и инкубируют в пробирках при температуре
27 ± 2°С в течение 3 дней.
Наблюдайте за ростом бактерии на углеродной среде. Утилизация
лактозы изменит цвет среды с ростом бактерий, в то время как неиспользование
лактозы не изменит цвет среды без какого-либо роста.
17.9. Ферментация углеводов
Ферментативная деградация различных углеводов, таких как глюкоза
(моносахарид), сахароза (дисахарид) и целлюлоза (полисахарид) микробами в
анаэробных условиях осуществляется в ферментационной трубке.
Ферментационная трубка-это культуральная трубка, содержащая трубку
Дарема (то есть небольшую трубку, помещенную в перевернутом положении в
культуральной трубке) для обнаружения газообразования как конечного
продукта метаболизма. Ферментационный бульон содержит ингредиенты
питательного бульона, специфический углевод (глюкоза, лактоза, мальтоза,
сахароза или маннит) и индикатор рН (красный фенол), который является
красным при нейтральном рН (7) и становится желтым при рН ниже 6,8 из-за
производства органической кислоты.
Необходимый материал
138
Бульон/уклон тестовых бактериальных культур, стерильные
ферментационные пробирки (из глюкозного бульона, лактозного бульона),
прививочная петля, Бунзеновская горелка, восковой маркировочный карандаш.
Методика
Приготовьте ферментационную среду из следующих компонентов:
триптиказа/пептон-10,0 г; углеводы-5,0 г; хлорид натрия-15,0 г; фенол красный
- 0,018 г; дистиллированная вода-1000,0 мл; рН-7,3 (добавляют специфические
углеводы, такие как глюкоза, сахароза и лактоза). Бульон берут в бродильные
трубки и автоклавируют при давлении 12 фунтов в течение 15 минут.
Маркируйте каждую из указанных ферментационных пробирок среды
названием организма, подлежащего инокуляции, инокулируйте три типа
сахарных ферментационных бульонов бактерией (по три на культуру) и
держите одну неокулированную пробирку каждого ферментационного бульона
в качестве сравнительного контроля. Инкубируйте все привиты и незасеянные
пробирки при температуре 28°C в течение 24-48 часов.
Понаблюдайте за реакциями, которые развиваются в трех
ферментационных средах, сравнивая с неокрашенными пробирками
(контроль), то есть изменение цвета (из-за производства кислоты) или
изменение цвета и появления пузырьков (из-за производства кислоты и газа)
находок.
17.10. Микробная реакция в лакмусовом молоке
Молоко является отличной средой для роста микроорганизмов,
поскольку оно содержит молочный белок казеин, молочный сахар лактозу,
витамины, минералы и воду. Лакмусовая бумажка, индикатор рН, включается
в среду для обнаружения производства кислоты или щелочи и окислительно–
восстановительной активности.
В молоке происходят различные химические изменения, в зависимости
от того, какие молочные ингредиенты используются бактериями. Опять же, это
зависит от типа ферментов, которые организм способен производить.
139
Лакмусовая молочная среда состоит из 10% сухого обезжиренного
молока и молекулы красителя лакмус.
Лакмус, при добавлении к регидратированному обезжиренному молоку,
изменяет коллоидную молочную суспензию с белой на лавандовую (бледноголубовато-фиолетовую).
Некоторые бактерии ферментируют лактозу молока с образованием
молочной кислоты, которая обнаруживается, когда лакмусовая среда
изменяется от синего или фиолетового (нейтральный рН) до красного или
розового (кислотный рН). Накопление кислоты действует на молочный белок,
казеин, в результате чего образуется творог (сгусток) за счет осаждения казеина
в виде казеината кальция, который очень твердый. По мере увеличения
кислотности творог становится настолько твердым, что происходит
выдавливание из него прозрачной жидкости (сыворотки). Кислый творог
идентифицируется по сгустку, который остается неподвижным, когда трубка
перевернута. Некоторые бактерии вырабатывают фермент, сычужный
фермент, который действует на казеин и в присутствии ионов кальция образует
параказеинат кальция, который нерастворим и называется сычужным
творогом. В отличие от кислого творога это мягкий полутвердый сгусток,
который будет медленно течь при наклоне трубки. Кислые или сычужные
твороги вполне приемлемы в качестве молочных продуктов, таких как творог.
Некоторые бактерии обладают протеолитическими ферментами
(например, казеиназой) и гидролизуют казеин (так называемый протеолиз,
пептонизация), что приводит к выделению большого количества аммиака,
который делает среду щелочной, имеет неприятный запах, а лакмусовая
бумажка становится пурпурно-синей. При дальнейшей инкубации среды
происходит непрозрачное очищение молока, так как казеин гидролизуется до
пептидов и аминокислот. Непрозрачный (мутный) жидкий супернатант
(похожий на сыворотку) приобретает коричневый цвет.
Некоторые бактерии ферментируют лактозу молока с образованием
кислоты и газов (например, CO2 + H2). Газообразование обнаруживается по
140
пузырькам в кислом твороге или по образованию дорожек или трещин внутри
творога.
Снижение лакмусовой бумажки за счет окислительно–
восстановительной активности бактерий может проявляться потерей
лакмусовой бумажки цвета. В лакмусовом молочном тесте лакмус
(фиолетовый в окисленном состоянии) действует как такой акцептор водорода
из субстрата и становится восстановленным и становится бело - или молочного
цвета.
Щелочная реакция, обусловленная частичным разложением казеина на
более короткие полипептидные цепи с одновременным высвобождением
щелочных конечных продуктов, проявляется тогда, когда цвет среды либо не
меняется, либо меняется на более глубокий синий.
Необходимый Материал
Триптиказный соевый агар наклонные культуры тест-бактерий,
стерильные пробирки лакмусовой молочной среды (пробирка 10 мл)
автоклавируют при 7 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 минут,
Бунзеновская горелка, инокуляционная петля, восковой маркировочный
карандаш.
Методика
Пометьте каждую из лакмусовых молочных пробирок средой с
бактерией, подлежащей инокуляции. Инокулируйте пробирки лакмусового
молока, используя петлевую инокуляцию, с бактериальными видами и держите
одну пробирку в качестве неинвазивного сравнительного контроля.
Инкубируйте инокулированные пробирки при температуре 28°С в течение 2448 часов. Охладите неинвазивную контрольную пробирку лакмусового молока.
Проводите частые наблюдения за инкубируемыми пробирками на предмет
цвета и консистенции среды и записывайте наблюдения.
Кислотная реакция (от розового до красного): демонстрирует
образование значительного количества кислоты. Щелочная реакция (от синего
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]