Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
221
Способ инокуляции и обнаружения Xanthomonas malvacearum:
Загруженных гусениц (CP) выпускают на здоровые растения, помещенные в
стеклянные камеры для обеспечения влажных условий, и наблюдают за
появлением симптомов.
В качестве альтернативы мацерат насекомого (1 Cp/2 мл воды)
инфильтрируют с помощью шприца для подкожных инъекций на нижнюю
поверхность хлопка cv. Acala-44, который очень чувствителен к Xanthomonas
malvacearum. Растения наблюдают за реакциями болезни.
Наличие бактерий (Xanthomonas malvacearum) у насекомого также может
быть определено специфическими бактериофагами и прямым выделением.
Понаблюдайте за листьями на предмет симптомов болезни, связанных с
замачиванием воды, когда загруженные гусеницы освобождаются и им
разрешают питаться. Аналогично наблюдайте за листьями, в которые
прививают мацерат гусеницы для развития реакции замачивания воды при
болезни.
Сообщается (Borkar and Verma, 1980), что в обоих случаях боллворм
переносит болезнь и симптомы болезни развиваются в течение 5-7 дней.
Экскременты боллового червя дали положительный результат на
присутствие Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum при типировании
бактериофагов и прямом выделении, что указывает на то, что болловый червь
и его экскременты служат переносчиком этого бактериального патогена.
222
27.2. Передача бактерий (xanthomonas) через насекомое/жука (красный
хлопковый жук)
Необходимый материал
Красный хлопковый жук, зараженные болезнью листья, здоровое
растение, инкубационные влажные камеры, клетки насекомых и так далее.
Методика
Собирайте красных хлопковых жуков с полей и содержите их на
хлопковых растениях в клетках. Голодание жуков осуществляется путем
содержания насекомых в пустых пластинах Петри в течение 8-12 часов перед
помещением их на чистую культуру Xanthomonas campestris pv. malvacearum в
пластинах Петри или на больные кусочки листьев для
кормления/перемещения, во время которого жуки приобретают бактерию. Они
называются загруженными жуками, которые должны быть выпущены на
здоровые растения, хранящиеся под полиэтиленовым покрытием, чтобы
избежать побега насекомых и обеспечить влажные условия для развития
болезни.
Для установления наличия бактерий в хлопковых клопах использовались
методы прямой изоляции от клопа и инфильтрации листьев (ЛИТ) для мацерата
клопов (Borkar et al., 1980). В ЛИТ клопов мацерировали и суспензию
инфильтрировали с помощью шприца для подкожных инъекций на нижнюю
поверхность хлопка cv., Acala-44, который очень чувствителен к Xanthomonas
campestris pv. malvacearum. У растения наблюдается реакция на болезнь. В
обоих случаях сообщалось (Borkar and Verma, 1980), что бактерия была
извлечена из насекомого, что указывало на нее как на вектор передачи.
27.3. Передача Erwinia amylovora через пчел
В яблоневых и грушевых садах возбудитель фитофтороза Erwinia
amylovora передается через насекомых-опылителей, в частности пчел, от
цветка к цветку в поисках нектара. Это можно продемонстрировать
следующими методами.
Необходимый материал
223
Опыление медоносных пчел из зараженных садов, здоровых медоносных
пчел, здоровых яблоневых/грушевых растений, муслиновой тканевой сетки,
питательных агаровых пластин и т. Д.
Методика
1. Соберите насекомых-опылителей или медоносных пчел из зараженных
пожаром яблоневых или грушевых садов с помощью сетки для сбора
насекомых.
а. Дайте нескольким насекомым/пчелам ползти по питательным
агаровым пластинам в течение минуты и инкубируйте пластины при
температуре 28°C в инкубаторе в течение 3 дней, чтобы наблюдать развитие
бактериальных колоний эрвинии.
б) Другой набор собранных насекомых переносится на цветущие
здоровые цветущие грушевые растения, накрывается муслиновой тканью и
крепко завязывается, чтобы избежать посещения других насекомых.
Наблюдайте за областями покрытия на предмет развития симптомов
заболевания в течение недели.
2. Соберите насекомых-опылителей или медоносных пчел из здоровых
яблоневых или грушевых садов с помощью сетки для сбора насекомых.
а) Позвольте нескольким насекомым/пчелам ползать по питательным
агаровым пластинам с культурой Erwinia amylovora в течение минуты, а затем
перенесите этих пчел на цветение здоровых цветущих растений груши.
Накройте муслиновой тканью и крепко завяжите, чтобы избежать визита
других насекомых. Наблюдайте за областями покрытия на предмет развития
симптомов заболевания в течение недели.
Образование колоний эрвиний в пластинках, где ползают медоносные
пчелы, собранные с зараженных садов, является положительным тестом на то,
что медоносные пчелы являются переносчиками возбудителя фитофтороза.
Точно так же развитие симптомов огненной порчи на здоровых цветках через
этих пчел указывает на передачу этого возбудителя насекомым.
224
27.4. Передача эрвинии через пятнистых жуков
Бактериальное увядание тыкв передается жуками, что является
серьезным заболеванием при выращивании тыкв. Передача бактериального
патогена жуком может быть продемонстрирована следующими методами.
Необходимый материал
Жуки с зараженного увяданием тыквенного поля, здоровые тыквенные
растения, жуки со здорового тыквенного поля, муслиновая тканевая сетка,
питательные агаровые пластины и так далее.
Методика
1. Соберите жуков с зараженного увяданием тыквенного поля с помощью
сетки для сбора насекомых.
а. Дайте нескольким жукам ползти по питательным агаровым пластинам
в течение минуты и инкубируйте пластины при температуре 28°С в инкубаторе
в течение трех дней, чтобы наблюдать развитие бактериальных колоний
эрвинии.
б) Другой набор собранных жуков следует перенести на здоровое
растение тыквы, накрыть муслиновой тканью и крепко привязать, чтобы
избежать посещения других насекомых. Наблюдайте за тыквенным растением
на предмет развития симптомов болезни увядания в течение двух недель.
2. Соберите жуков со здорового тыквенного поля с помощью сетки для
сбора насекомых. Позвольте немногочисленным жукам ползать на
питательных агаровых пластинках с культурой Erwinia trichiphila в течение
минуты и перенесите этих жуков на здоровые тыквенные растения. Накройте
муслиновой тканью и крепко завяжите, чтобы избежать посещения других
насекомых. Наблюдайте за тыквенными растениями на предмет развития
симптомов болезни увядания в течение двух недель.
Образование колоний эрвиний в пластинках, по которым ползают жуки
от зараженного культивирования тыквы, свидетельствует о положительных
результатах переноса бактерии жуком. Развитие симптомов заболевания у
225
здоровых тыкв через зараженных жуков указывает на передачу возбудителя
насекомым.
27.5. Передача эрвинии нематодами
Возбудитель корневищной гнили или воротниковой гнили банана, то
есть Erwinia chrysanthemi, передается нематодами (Nagarale, 2000), что
является серьезным заболеванием при выращивании бананов. Передача
бактериального патогена нематодами может быть продемонстрирована
следующими методами.
Необходимый материал
Нематоды, собранные с воротничковой гнили,–зараженные корневища
бананов с зараженного поля, здоровые корневища бананов, нематоды,
собирающие аппарат, питательные агаровые пластинки и т. д.
Методика
1. Соберите нематод с пораженных гнилью корневищ воротника с
помощью нематодосборного аппарата.
а. Дайте нескольким нематодам ползти по питательным агаровым
пластинам в течение минуты и инкубируйте пластины при температуре 28°С в
инкубаторе в течение трех дней, чтобы наблюдать развитие бактериальных
колоний эрвинии.
б. Другой набор собранных нематод переносят на здоровое корневище
банана и высаживают в здоровую почву в горшок. Храните привитые растения
в стеклянном доме в подходящих климатических условиях для развития
симптомов воротниковой гнили. Наблюдайте за банановым растением на
предмет развития симптомов болезни воротниковой гнили в течение двух
недель.
2. Соберите нематод со здорового бананового поля с помощью аппарата
для сбора нематод.
а) Дайте нескольким нематодам ползти по питательным агаровым
пластинам с культурой Erwinia chrysanthemi в течение минуты, а затем
перенесите этих нематод на здоровое корневище банана и посадите его в
226
здоровую почву в горшке. Храните привитые растения в стеклянном доме в
подходящих климатических условиях для развития симптомов воротниковой
гнили. Наблюдайте за банановым растением на предмет развития симптомов
болезни воротниковой гнили в течение двух недель.
Образование колоний эрвиний в пластинках питательного агара, куда
заползли нематоды из зараженного корневища банана, свидетельствует о
положительных результатах переноса бактерии нематодой. Развитие
симптомов заболевания у здоровых корневищ банана через зараженную
нематоду указывает на передачу возбудителя насекомым.
227
28. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УВЕКОВЕЧИВАНИЯ
БАКТЕРИАЛЬНОГО ПАТОГЕНА РАСТЕНИЙ
Увековечивание бактериального растительного патогена можно назвать
выживанием бактерий в данном субстрате или материале в течение
длительного периода времени.
28.1. В почве
Известно, что растительные патогенные бактерии рода Agrobacterium,
Ralstonia и Erwinia присутствуют и выживают в почве, поскольку они являются
почвенными бактериальными патогенами растений.
Необходимый материал
Образцы почвы с признаками увядания/корончатой гнили/мягкой гнили,
дистиллированная стерильная вода, питательные агаровые пластины.
Методика
Соберите образец почвы, правильно маркируйте, храните в условиях
окружающей среды и анализируйте его через разные промежутки времени.
Растворите 1 г образца почвы в 25 мл дистиллированной стерильной воды с
перемешиванием на магнитном шейкере в течение 10 минут. Отфильтруйте
пробный раствор через фильтровальную бумагу Whatman № 24, чтобы удалить
почвенный материал и собрать фильтрат. Сделайте последовательное
разведение до 10-6. Пластину по 0,2 мл каждого разведения помещают на
отдельную питательную агаровую пластину, намазывают стеклянной палочкой
и инкубируют пластинки в инкубаторе при температуре 27 ± 2°С.
Понаблюдайте за бактериальными колониями на каждой пластинке,
отметьте их морфологические характеристики и сравните их с исходной
культурой бактериального растительного возбудителя, проявляющего
симптомы заболевания.
Для определения увековечивания бактерий в почве одна и та же
процедура или эксперимент должны проводиться с различными интервалами
(в днях/в месяцах/в годах) и определять увековечивание. Период времени, в
228
течение которого была обнаружена последняя бактериальная популяция из
почвы, рассматривается как период увековечения бактериального патогена в
почве.
28.2. В посадочном материале
Большинство патогенных бактерий растений выживают в зараженном
растительном материале, особенно растительный мусор, упавший на
землю/похороненный в почве.
Необходимый материал
Зараженные опавшие листья/мусор/корни/остатки растений,
дистиллированная стерильная вода, питательные агаровые пластины.
Методика
Соберите растительный мусор/опавшие листья/остатки, правильно
маркируйте их и храните в условиях окружающей среды. Измельчите 1 г
исследуемого материала в 20 мл дистиллированной стерильной воды с
помощью пестика и ступки и дайте отстояться в течение 5 минут. Пипеткой
извлеките суспензию из измельченного материала и отфильтруйте через
фильтровальную бумагу Whatman № 24, чтобы удалить взвешенный
измельченный материал. Приготовьте из фильтрата последовательное
разведение до 10-6. Пластину по 0,2 мл каждого разведения помещают на
отдельную питательную агаровую пластину, намазывают стеклянной палочкой
и инкубируют пластинки в инкубаторе при температуре 27 ± 2°С.
Понаблюдайте за бактериальными колониями на каждой пластинке,
отметьте их морфологические признаки и сравните с исходной культурой
бактериального растительного возбудителя, проявляющего симптомы
заболевания.
Примечание: Колонии растительных патогенных бактерий обычно
появляются после 2-3 дней инкубации.
Для определения увековечивания бактерий в посадочном материале одна
и та же процедура или эксперимент должны проводиться с различными
интервалами (в днях/в месяцах/в годах) и определяться увековечивание.
229
Период времени, в течение которого была обнаружена последняя
бактериальная популяция из собранного и хранящегося образца, считается
периодом увековечения бактерий в зараженном посадочном материале.
28.3. В семенном материале
Некоторые бактериальные патогены растений выживают и закрепляются
в семенах как внешние или внутренние возбудители болезней растений и
передают болезнь с одного поля на другое, из одного сезона в другой и из одной
местности в отдаленные места. Поэтому выявление увековечивания
бактериального патогена растений в семенных партиях имеет важное значение.
Необходимый материал
Семена хлопчатника, зараженные патогеном черной руки, семена фасоли
и кунжута, зараженные бактериальным патогеном пятнистости листьев,
дистиллированная стерильная вода, питательная агаровая пластина.
Методика
Соберите семенной материал из ранее зараженной бактериальным
патогеном культуры, правильно маркируйте его и храните в условиях
окружающей среды. Измельчите один грамм образца семян в 20 мл
дистиллированной стерильной воды в пестике и ступке и дайте отстояться в
течение 5 минут. Пипеткой извлеките суспензию из измельченного материала
и отфильтруйте через фильтровальную бумагу Whatman № 24, чтобы удалить
взвешенный измельченный материал. Пластину 0,2 мл суспензии на
питательной агаровой пластине, намазывают стеклянной палочкой и
инкубируют пластинки в инкубаторе при температуре 27 ± 2°С.
Понаблюдайте за бактериальными колониями на каждой пластинке,
отметьте их морфологические признаки и сравните с исходной культурой
бактериального растительного возбудителя, проявляющего симптомы
заболевания в поле, с которого собирают партию семян.
Примечание: Колонии растительных патогенных бактерий обычно
появляются после 2-3 дней инкубации.
230
Для определения увековечивания бактерий в семенном материале одна и
та же процедура или эксперимент должны проводиться с различными
интервалами (в днях/в месяцах/в годах) и определяться увековечивание.
Период времени, в течение которого была обнаружена последняя
бактериальная популяция из собранной и хранящейся семенной пробы,
рассматривается как период увековечения бактерий в материале семенной
партии.
28.4. В векторе
Некоторые из патогенных бактерий растений передаются насекомымипереносчиками. На этих насекомых-переносчиках бактерии выживают или
увековечиваются внешне или внутренне.
Необходимый материал
Переносчики насекомых и их возрастные группы, дистиллированная
стерильная вода, питательные агаровые пластины.
Методика (Для внешнего увековечения)
Соберите насекомых с больного поля и дайте им ползти по питательной
агаровой пластинке. Инкубируйте пластины при температуре 27 ± 2°C.
Соберите насекомых с больного поля и храните их в лаборатории в
условиях окружающей среды. Через разные промежутки времени берут
несколько образцов насекомых, суспендируют их в дистиллированной
стерильной воде (2 мл) и перемешивают на магнитной мешалке. Удалите
насекомое и отфильтруйте суспензию через стерильную фильтровальную
бумагу Whatman № 24 в стерильной пробирке. Пластину 0,2 мл суспензии на
питательной агаровой пластине инкубируют при температуре 27 ± 2°С.
Наблюдайте за пластинкой для колоний растительных патогенных
бактерий, нанесенных через различные промежутки времени, чтобы
определить увековечивание бактерий у насекомых.
Методика (Для внутреннего увековечения)
Соберите насекомых с больного поля и дайте им возможность линять в
разные стадии/возраст. Возьмите различные линьки в соответствующее время
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]