Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
331
мультиплексирующей способностью, то есть способны измерять несколько
антител или антигенов одновременно. Расходомер состоит из трех частей:
Обработка образцов – Проточная ячейка и связанная с ней флюидика
Светочувствительность – Источник света, оптика и детекторы рассеяния
и флуоресценции света
Обработка сигналов – Сбор и анализ данных
Приборы
Флюидика
Оболочка жидкости: Она состоит из столба жидкости с ламинарным
потоком. Скорость потока составляет 10 м/с, когда изотоническая жидкость
под давлением пропускается через трубку в проточную ячейку, также
называемую “Сердцем расходомера".”
Ядро образца: Образец вводится в проточную ячейку с помощью
управляемого компьютером шприца в центре жидкости оболочки, создавая
коаксиальный поток внутри потока. Давление потока оболочки
гидродинамически выравнивает ячейки, так что они представляются световому
лучу по одному.
Источник света и световой луч: Лазерный луч аргонового типа действует
как чувствительная система. Чувствительность и разрешающая способность
зависят от формы и интенсивности лазерного луча, определяемого двумя
цилиндрическими линзами. Первая линза (вертикальная) приводит к
эллиптическому лучу с более длинным вертикальным размером
(перпендикулярно оси потока) и более коротким горизонтальным размером
(вдоль оси потока). Вторая линза (горизонтальная) изменяет луч так, что его
горизонтальный размер больше вертикального. Удлинение горизонтальной оси
увеличивает разрешающую способность прибора. Укорочение оси повысит
чувствительность. Вертикальная ось управляет различением между двумя
близко расположенными ячейками, такими как дублеты (Wood et al., 1993).
Рассеяние света: Свет, рассеянный в прямом направлении, называется
прямым рассеянием (FSC) или прямым углом рассеяния света и зависит от
332
размера или объема ячейки. Свет, рассеянный в сторону, является боковым
рассеянием (SSC) или прямым углом рассеяния света или 90° рассеяния света.
FSC дает меру размера ячейки, а SSC-топографию поверхности и
гранулярность ячейки. FSC и SSC впоследствии дают интересующую
клеточную популяцию, которую можно построить на компьютере с помощью
мыши.
Флуоресцентный свет и обработка сигналов: Некоторые красители или
флуорохромы поглощают лазерный свет на определенной длине волны и
излучают свет на более длинных длинах волн-явление, известное как
флуоресценция. Длина волны флуоресценции должна быть больше длины
волны возбуждения для разделения. Это различие называется сдвигом хода.
Когда флуоресцентный краситель, прикрепленный к клетке, проходит через
лазерный луч, он излучает свет, который собирается, усиливается и
преобразуется в импульсы напряжения. Высота импульса связана с
интенсивностью флуоресценции, а ширина импульса-с распределением
красителя на поверхности. Небольшие ворота выбираются путем определения
региона на подготовленном для выбора интересующего населения участке.
Ворота выбираются путем определения области на одномерной гистограмме
или цитограмме (двумерная хостограмма). Только клетки, попадающие в
ворота, могут пройти на следующую стадию анализа. Ворота также
используются для выбора желаемых популяций для сортировки клеток.
31.11. Содержание дезоксирибонуклеиновой кислоты в бактерии, ее связь
с вирулентностью и лекарственной устойчивостью
Необходимые материалы
Расы Xanthomonas campestris pv. malvacearum, среда производства
экзополисахаридов, ДНК, выделенная из этих рас.
Методика
Использовать наиболее вирулентную расу-32 (способную атаковать пять
генов бактериальной устойчивости к фитофторозу, а именно полиген + B7 +
B2+BIn+BN), менее вирулентную расу-8 (способную атаковать полиген + B2)
333
и расу-1 (не способную атаковать ни один ген бактериальной устойчивости к
фитофторозу), а также авирулентный стрептомицинрезистентный мутант
расы-32 и расы-1 (раса-1 также потеряла свою вирулентность из-за
многократного субкультурирования и используется в качестве авирулентного
штамма) для извлечения и оценки экзополисахаридов и генов, устойчивых к
фитофторозу. Содержание ДНК.
Собирают экзополисахарид (ЭПС) из вышеперечисленных рас
Xanthomonas campestris pv. malvacearum, как описано в предыдущих
экспериментах, и оценивают его содержание белка методом Фолина–Лоури.
Извлечение, обнаружение и количественная оценка ДНК
Расы Xanthomonas campestris pv. malvacearum суспендировали в 5 мл
трис-буфера (0,05 М, рН 8,0) и доводили до экстинкции 1,0 при 620 нм. К
суспензии добавляли один мл лизоцима (5 мг/мл воды) и 1 каплю CHCl3 и
выдерживали в течение часа. К этому добавляли десятипроцентный натрийлаурилсульфат (0,2 мл) и выдерживали пробирки на водяной бане при 40°С в
течение 10 минут. Раствор NaCl (5 М) добавляли в бактериальный лизат для
получения конечной концентрации NaCl до 1 М и хранили в течение ночи при
температуре 4°С. Его центрифугировали при 15000 об / мин в течение 15 минут.
Супернатант декантировали, остатки растворяли в 5 мл стерилизованной воды
и экранировали в УФ-диапазоне (от 235 до 290 нм) спектрофотометра для
обнаружения присутствия ДНК.
Проводят количественную оценку ДНК по методу Бертона.
Соотнесите количество ДНК с вирулентностью изолята Xam. Коррелируйте
количество ЭПС с вирулентностью изолята Xam. Коррелируйте количество
ДНК с производством ЭПС. Коррелируют количество ДНК резистентного к
стрептомицину (авирулентного) мутанта и чувствительного к стрептомицину
(вирулентного) xam расы-32.
334
32. БАКТЕРИОФАГИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
РАСТЕНИЙ
Бактериофаги - это вирусы, которые заражают и лизируют или убивают
бактерии. Они широко распространены в природе везде, где существуют
бактерии-хозяева, и могут быть двух типов.
1. Специфические фаги: Они атакуют только одну или группу тесно
связанных бактерий и часто встречаются в высоких концентрациях, где
присутствуют их бактерии-хозяева, а именно инфицированная ткань,
ризосфера зараженного растения, полевая вода и почва. В некоторых случаях
они также переносятся в чистой культуре бактерий-хозяев.
2. Неспецифические фаги: Они встречаются повсеместно, в изобилии в
почве, речной воде и часто в здоровых растительных материалах. Обычно они
встречаются в очень низких концентрациях. Инфекция и процесс
бактериального лизиса происходят двумя способами, и на основании этого
бактериофаги известны либо как литические фаги, либо как лизогенные фаги.
a. Литические фаги: бактериофаг заражает бактерию-хозяина и берет под
контроль механизм синтеза ДНК бактериальной клетки для синтеза
собственных вирусных частиц в бактериальной клетке-хозяине. Синтез и,
следовательно, присутствие большого количества вирусных частиц в
бактериальной клетке приводит к разрыву бактериальной клетки и, таким
образом, вызывает лизис бактериальной клетки.
б. Лизогенные фаги: Бактериофаг заражает бактерию-хозяина и
высвобождает свой ДНК-материал в бактериальную клетку, которая
интегрируется с бактериальной хромосомной ДНК, и бактерии размножаются
в том же состоянии. При определенных условиях, таких как радиация или
тепловые/холодовые удары, в бактериальной клетке происходит синтез
вирусных частиц и происходит лизис.
Бактериальный род, вид или патогенные микроорганизмы
специфические бактериофаги могут быть использованы для идентификации
335
бактериальных видов или патогенных микроорганизмов. Литические фаги
могут быть использованы для обнаружения присутствия бактерий в
карантинном растительном материале. Аналогичным образом они могут быть
использованы при управлении популяцией бактерий, ответственных за
возникновение и распространение заболеваний.
32.1. Выделение литических фагов
32.1.1. Прямым методом
Из зараженного растительного материала: Один грамм материала мелко
нарезают и суспендируют в 50 мл стерильной воды в 100 мл конических колбах
и инкубируют при 25-28 °C в течение 48 часов.
Из почвы: 5-10 г зараженной почвы суспендируют в 25-50 мл воды,
хорошо встряхивают и оставляют на несколько часов при комнатной
температуре.
Из полевой воды: Воду с поля собирают и дают ей отстояться в течение
нескольких минут.
Из культур: Исходные культуры как таковые или после облучения
ультрафиолетовым светом выращивают в жидкой среде в течение 48 часов.
Супернатанты при вышеуказанных обработках декантируют. Если они
мутные, их центрифугируют при 6000 об/мин и фильтруют через фильтры,
защищающие от бактерий. Фильтрат проверяется на наличие фага.
Фильтрацию через фильтры, защищающие от бактерий, можно заменить
обработкой хлороформом. Десять мл надосадочной жидкости смешивают с 0,5
мл хлороформа в пробирке и энергично встряхивают. Затем хлороформу дают
отстояться, а надосадочную жидкость проверяют на наличие фага.
32.1.2. Косвенный метод или метод обогащения
Этот метод используется для выделения фагов, присутствующих в
низких концентрациях в почве или зараженном посадочном материале. Для
создания популяции фагов на обнаруживаемых уровнях материал или образец
почвы должны быть взвешены в воде и привиты суспензией активно растущей
бактерии-хозяина фага и инкубированы в течение 48-72 часов для увеличения
336
титра фага. Этот обогащенный материал используется для выделения фагов,
как описано в прямом методе.
32.1.3. Обнаружение фага
Наличие фага определяется точечным тестом. Смешайте 1 мл
бактериальной суспензии с 25 мл расплавленной охлажденной питательной
агаровой среды и вылейте в стерилизованную чашку Петри, предварительно
размеченную на четыре равных сектора. Когда агар затвердеет, поместите 0,5
мл тестовой жидкости на каждый сектор. Инкубируйте пластины при
оптимальной температуре роста бактерии-хозяина в течение 48 часов. Если фаг
присутствует в тестируемой жидкости, пятнистая область будет чистой и
лишенной бактериального роста из-за лизиса бактерии в тестируемой области
из-за литического действия фага.
Отрежьте кусочек агара (2 мм) от литической области и перелейте в
пробирку 5 мл стерильной дистиллированной воды. Вода перемешивается
таким образом, чтобы фаг попал в суспензию из кусочка агара. Фаг в этой
суспензии очищается с помощью теста на зубной налет.
Очистка фага
Для этого смешайте 1 мл подходящего разведения исходного фага с 1 мл
суспензии гомологичной бактерии в стерильной пробирке. Добавьте эту смесь
фагов и бактерий в 25 мл расплавленной питательной агаровой среды в колбе
объемом 100 мл. Тщательно перемешайте содержимое и вылейте в стерильную
тарелку. После того как агар затвердеет, инкубируйте пластину в перевернутом
положении при оптимальной температуре роста бактерии-хозяина в течение 48
часов. Четкие литические участки, называемые бляшками, развиваются в
течение 24 часов. Через 48 часов разрежьте бляшки, различные по размерам и
другим морфологическим признакам, вместе со средой и перенесите отдельно
в 5 мл стерильной дистиллированной воды в пробирках. Фаг из этих отдельных
бляшек снова дважды очищается с помощью теста на бляшки. Перенесите
бляшку, содержащую очищенный фаг, в столб стерильной воды объемом 5 мл
и храните при температуре 5-7°C в качестве исходного раствора фага.
337
32.1.4. Характеристика фага
Фаг должен быть изучен на предмет следующих свойств.
1. Диапазон хозяев: Проверьте фаг на его способность атаковать
различные виды бактерий и штаммы с помощью точечного теста, как описано
ранее, чтобы определить диапазон хозяев и специфичность хозяина.
2. Морфология зубного налета: Морфология зубного налета изучается на
основе размера зубного налета, типа края и того, являются ли они прозрачными
или мутными.
3. Электронная микроскопия: Суспендируйте бляшку в 2 мл стерильной
дистиллированной воды. Нанесите каплю этой суспензии на медную сетку с
покрытием formvar. Затемните эти установленные сетки в условиях высокого
вакуума сплавом золото-палладий (60:40) под подходящим углом (250) и
изучите форму фага, например, Т-образную или иную под электронным
микроскопом.
4. Время образования зубного налета: Разведения исходного фага
помещают против индикаторной бактерии-хозяина для развития одного
зубного налета. Отмечается время, необходимое для появления налета. Для
данной системы при заданном наборе условий время образования зубного
налета является постоянным.
5. Количество частиц, образующих бляшки, на мл: Разведения фагов,
полученных из отдельных полностью сформированных бляшек, наносятся для
образования единичных бляшек. Количество частиц, образующих бляшки, на
мл определяется путем умножения среднего количества бляшек на пластину и
коэффициента разведения.
6. Точка термической смерти: Возьмите суспензию фага (0,5 мл) в
стерильных капиллярных пробирках. Трубки подвергаются различным
температурам в термостатически регулируемых водяных ваннах в течение 10
минут каждая. После обработки перенесите трубки в прохладную воду, чтобы
охладить их. Суспензию окрашивают на индикаторных бактериях-хозяевах для
338
определения жизнеспособности фага по образованию налета и коррелируют с
температурной обработкой для определения точки термической смерти.
7. Конечная точка разведения: Пластинчатые десятикратные
последовательные разведения суспензии исходного фага с индикаторными
бактериями. Инкубируйте пластины и наблюдайте за развитием зубного
налета. Конечная точка разведения - это то разведение, после которого бляшки
не наблюдаются.
32.2. Типирование бактериальных фагов
Необходимый Материал
Пластины питательного агара, раствор фага, тестовая бактерия, пустая
вода и так далее.
Методика
Приготовьте суспензию исследуемой бактерии (0,1 ЕД) и добавьте в
теплую стерилизованную питательную агаровую среду (1 мл бактериальной
суспензии в 25 мл стерильной среды) и вылейте в стерилизованную тарелку.
Дайте среде затвердеть под действием ламинарного потока. Добавьте 0,1 мл
раствора фага на тестируемую бактериальную среду и инкубируйте пластины
при температуре 27 ±2 °C в инкубаторе в течение 48 часов. Наблюдайте за
пластинами для образования прозрачных бляшек.
Наблюдение
Образование прозрачных бляшек на бактериальном газоне указывает на
то, что бактериофаг специфичен для бактерий, и, таким образом, изучается
типирование бактериальных фагов.
32.3. Определение титра фага
Необходимый Материал
Исходный раствор фага, бактериальная культура, специфичная для фага,
питательная агаровая среда, пустая вода и так далее.
Методика
339
Приготовьте последовательное разведение исходного раствора фага до
10-7. приготовьте суспензию бактериальной культуры, специфичной для фагов
(0,1 ЕД при 620 нм), и добавьте 1 мл бактериальной суспензии к 25 мл
тепловатой стерилизованной питательной агаровой среды. Теперь добавьте 1
мл известного серийного разведения исходного раствора фага. Перемешайте
содержимое, вращая на рабочем столе, и вылейте в стерильную тарелку Петри.
Повторите процесс для каждого последовательного разведения культуры фага.
Инкубируйте пластины в течение 48 часов при температуре 27 ±2 °C и
подсчитайте количество бляшек.
Подсчитайте количество бляшек в последних разведениях и рассчитайте
титр фага, умножив коэффициент разведения. Титр фага выражается в
единицах образования бляшек/мл исходного раствора.
32.4. Выделение лизогенных фагов
Необходимый Материал
Бактериальные изоляты Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,
Xanthomonas campestris pv. glycineae, Xanthomonas campestris pv. erythrinae,
Xanthomonas campestris pv. azadirachtae, Xanthomonas campestris pv. clerodendri,
Xanthomonas campestris pv. rhynchosia и Xanthomonas campestris pv.
malvacearum, известные как носители лизогенных фагов (Боркар, 1997).
Методика
Чтобы выделить умеренные фаги из лизогенных бактериальных культур,
приостановите экспоненциальный рост (107 кое/мл) этих бактериальных
изолятов отдельно в 50 мл питательного бульона и инкубируйте в обычных
условиях культивирования (при 28°C) в течение 48 часов. После того, как
наблюдается полный рост, держите один набор в обычном состоянии роста, а
другой - при температуре 4 °C, чтобы дать бактериям шоковую обработку для
высвобождения фагов. Инкубируйте эти культуры в течение недели в этих
условиях. Считайте рост бактерий в бульонном растворе двух наборов в
небольшой аликвоте при 620 нм в spectronic-20, а также визуально наблюдайте
за мутностью роста бактерий. Рост бактерий там, где мутность теряется,
340
указывает на лизис бактерий из-за высвобождения лизогенных или умеренных
фагов. Для сбора умеренных фагов отфильтруйте лизированный рост
соответствующей бактерии в питательном бульоне через бактериологический
фильтр (0,45 мкм) и соберите фильтрат, содержащий умеренные фаги, и
храните в асептических условиях в морозильной камере.
Проверьте реакцию этих температурных фагов на различные патогены
Xanthomonas campestris. Чтобы проверить реакцию умеренных фагов
Xanthomonas campestris pv. erythrinae, Xanthomonas campestris pv. azadirachtae и
Xanthomonas campestris pv. malvacearum на различные патогены Xanthomonas
campestris, смешайте 0,1 мл суспензии фагов отдельно и индивидуально с
культурами Xanthomonas campestris pv. vesticatoria, Xanthomonas campestris pv.
rhynchosia, Xanthomonas campestris pv.glycineae, и Xanthomonas campestris pv.
клеродендри в питательном бульоне в колбе. Инкубируйте колбу при
температуре 28 ±2 °C для роста бактерий. После достижения полного роста в
течение 48 часов подвергните выращенную культуру шоковой обработке либо
ультрафиолетовым излучением, либо холодной обработкой при температуре от
0 до 4 °C для высвобождения фагов, вызывающих лизис инфицированных
бактерий.
Высвобождение умеренных фагов из бактериального роста вызывает
лизис бактерий, потерю мутности и прозрачный раствор для роста в противном
случае бактериального роста в бульоне.
32.5. Сохранение бактериофагов
Методика
Привейте 48-часовую растущую культуру бактерий, специфичных к
фагам, в питательный бульон (пептон, 5 г; экстракт говядины, 3 г; вода 1 л) и
инкубируйте колбы при 28°C в течение 48 часов на шейкере туда-сюда.
Добавьте 1 мл суспензии фага, приготовленной из одного фага, в питательный
бульон, содержащий рост бактерий, и инкубируйте в течение 48 часов.
Отфильтруйте бульон через фильтр, защищающий от бактерий (ультратонкий,
G-5), чтобы отделить фаги. Маркируйте фильтрат, содержащий суспензию
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]