Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
261
антисыворотки. В результате сложения частиц появляются комплексы,
которые можно увидеть под электронным микроскопом.
Этот метод особенно полезен, когда низкая концентрация бактерий
препятствует прямому наблюдению. Избыток антител приведет к
ингибированию реакции, как в тестах на преципитацию.
30.4.6. Иммуноферментный анализ (ИФА)
Поскольку чувствительность ИФА для обнаружения растительных
патогенных бактерий обычно относительно низка (около 105-106 кое/мл) из-за
более низкой способности бактерий покрывать пластины по сравнению с
вирусами и некоторых других проблем (Alvarez, 2004), перед ИФА может быть
выполнена предшествующая стадия обогащения (непрямые форматы DAS или
DASI) для повышения чувствительности обнаружения при сохранении
специфичности. Это особенно необходимо при использовании специфических
моноклональных антител (Lopez et al., 2003). Этот шаг не нужен для
идентификации чистых культур. Обогащение следует проводить с
использованием наиболее подходящих условий инкубации (например,
температуры, потребности в кислороде, встряхивания и среды), указанных в
диагностическом протоколе для конкретного вредителя. Обогащение может
потерпеть неудачу из-за присутствия или развития других микроорганизмов, и
его следует избегать, когда это предсказуемо.
1. Непрямой ELISA
а. Используйте 200 мкл (количество пробы может быть уменьшено до 100 мкл
в зависимости от объема пробы) аликвот приготовленного экстракта пробы,
мацерата или бактериальной суспензии (в соответствии с инструкциями
протокола) в 1,5–2,0 мл микро-флаконах.
б. Добавьте равный объем буфера покрытия двойной прочности и вихря.
c. Нанесите эквивалентный объем образца на две лунки микротитровой
пластины с хорошими характеристиками покрытия (например, Nunc-PolySorp
или эквивалент) и избегайте границ пластины для лучшей повторяемости.
Некоторые методы доступны для предотвращения пограничного эффекта,
262
такие как покрытие пластины прозрачной пленкой, чтобы избежать испарения,
в таких случаях могут быть использованы пограничные скважины.
Инкубировать при температуре 37°C в течение 4 часов или в течение ночи при
температуре 4°C. Подготовьте положительные и отрицательные элементы
управления таким же образом. Также необходимо включить отрицательный
контроль экстракционного буфера и обогащающей среды, когда это
необходимо.
d. Осторожно промойте лунки (например, с помощью промывочной бутылки)
три раза PBS-Tween, так как слишком сильная промывка с помощью некоторых
моющих устройств может повлиять на результат покрытия и, следовательно,
на чувствительность, особенно при обнаружении.
e. Приготовьте соответствующее разведение специфических антител в
соответствующем блокирующем буфере. Для валидированных коммерчески
доступных антител используют рекомендуемые рабочие разведения.
f. Добавьте 200 мкл в каждую лунку и инкубируйте в течение 2 часов при
температуре 37°C.
g. Промойте, как и раньше (d).
h. Приготовьте соответствующее разведение конъюгированных вторых
специфических антител (обычно конъюгированных с щелочной фосфатазой, но
могут также использоваться и другие ферменты) в соответствующем
блокирующем буфере. Добавьте 200 мкл этого раствора в каждую лунку.
Инкубируйте в темноте при комнатной температуре и считывайте поглощение
при 405 нм (или при рекомендуемой длине волны для других ферментно–
субстратных реакций) через регулярные промежутки времени в течение 120
минут или в соответствии с протоколом.
2. DAS-ELISA
а. Приготовьте соответствующее разведение антител в карбонатном покрытии
буфера рН 9,6. Добавьте по 200 мкл в каждую лунку микротитра пластин с
хорошими характеристиками покрытия, например Nunc-PolySorp или
эквивалент, и избегайте границ пластины для лучшей повторяемости.
263
Некоторые методы доступны для предотвращения пограничного эффекта,
такие как покрытие пластины прозрачной пленкой, чтобы избежать испарения,
в таких случаях могут быть использованы пограничные скважины.
Инкубировать при температуре 37°C в течение 4 часов или при температуре
4°C в течение ночи.
б. Осторожно промойте лунки (например, с помощью промывочной бутылки)
PBS Tween, так как слишком сильная промывка с помощью некоторых
моющих устройств может повлиять на результат покрытия и, следовательно,
на чувствительность, особенно при обнаружении.
в) Добавьте 200 мкл каждого образца (растительного экстракта, мацерата или
бактериальной суспензии) в две лунки, предварительно обогащенные или
обработанные, если это необходимо. Включите две лунки на пластину
положительного и отрицательного контроля. Также необходимо включить
отрицательный контроль экстракционного буфера и используемой
обогащающей среды. Инкубировать 4 часа при температуре 37°C или ночь при
температуре 4°C.
d. Мойте, как и раньше (b).
e. Приготовьте соответствующее разведение специфических антител,
конъюгированных со щелочной фосфатазой (или связанных с другим
ферментом) в PBS. Добавьте 200 мкл в каждую лунку. Инкубировать при
температуре 37°C около 2 часов.
f. Мойте, как и раньше (b).
g. Приготовьте свежий раствор (1 мг мЛ/1) п-нитрофенилфосфата в буфере
субстрата щелочной фосфатазы. Для других ферментов следуйте
рекомендациям коммерческого набора. Добавьте 200 мкл этого раствора в
каждую лунку. Инкубировать при комнатной температуре и считывать
поглощение при 405 нм (для других комбинаций фермент–субстрат следуйте
рекомендациям поставщика набора) через регулярные промежутки времени в
течение 120 минут или в соответствии с протоколом.
3. ДАСИ ЭЛИЗА
264
а. Приготовьте соответствующее разведение поликлональных антител в
карбонатном буфере покрытия рН 9,6. Добавьте 200 мкл в каждую лунку
микротитровой пластины с хорошими характеристиками покрытия и избегайте
границ пластины для лучшей повторяемости. Некоторые методы доступны для
предотвращения пограничного эффекта, такие как покрытие пластины
прозрачной пленкой, чтобы избежать испарения, в таких случаях могут быть
использованы пограничные скважины. Инкубировать при температуре 37°C в
течение 4 часов или в течение ночи при температуре 4°C.
б. Осторожно промойте лунки (например, с помощью промывочной бутылки)
PBS Tween, так как слишком сильная промывка с помощью некоторых
моющих устройств может повлиять на результат покрытия и, следовательно,
на чувствительность, особенно при обнаружении.
в) Добавьте 200 мкл каждого образца (растительного экстракта, мацерата или
бактериальной суспензии) в две лунки, предварительно обогащенные или
обработанные, если это необходимо. Включите две лунки на пластину как для
положительного, так и для отрицательного контроля. Также необходимо
включить отрицательный контроль экстракционного буфера и используемой
обогащенной среды. Инкубировать в течение 4 часов при температуре 37°C или
в течение ночи при температуре 4°C.
d. Мойте, как и раньше (b).
приготовьте соответствующее разведение специфических антител
(предпочтительно моноклональных) в PBS pH 7,2 плюс 0,5% бычьего
сывороточного альбумина (BSA) и добавьте 200 мкл в каждую лунку.
Инкубировать при температуре 37°C около 2 часов и промыть, как и раньше
(б).
f. Приготовьте соответствующее разведение антивидовых антител (при
использовании моноклональных: противомышечных иммуноглобулинов),
конъюгированных со щелочной фосфатазой (или связанных с другим
ферментом) в PBS. Добавьте по 200 мкл в каждую лунку. Инкубировать при
температуре 37°C около 2 часов.
265
g. Мойте, как и раньше (b).
приготовьте раствор 1 мг мЛ/1 п-нитрофенилфосфата в субстратном буфере
щелочной фосфатазы. Для других ферментов следуйте рекомендациям
коммерческого набора. Добавьте 200 мкл в каждую лунку. Инкубировать при
комнатной температуре и считывать поглощение при 405 нм (для других
комбинаций фермент–субстрат следуйте рекомендациям поставщика набора)
через регулярные промежутки времени в течение 120 минут или в соответствии
с протоколом.
4. Tissue print, squash или colony dot ELISA
а. Используйте нитроцеллюлозную мембрану с таблицами, напечатанными
производителем, или вырежьте прямоугольный нитроцеллюлозный лист и
нарисуйте (с помощью линейки и карандаша) таблицу с 12 столбцами и 8
строками на каждом. Отметьте строки ячеек A–H и столбцы 1-12.
Микропланшет ELISA обеспечивает хороший шаблон.
Подготовьте гладкие, свежесрезанные кусочки симптоматических
растительных тканей и прижмите их к нитроцеллюлозной мембране, чтобы
получить тканевый отпечаток.
Непосредственно раздавите симптоматический растительный материал
или бактериальный экссудат на нитроцеллюлозную мембрану.
Непосредственно на нитроцеллюлозную мембрану наносят колонию или
суспензию бактерии-мишени. Включите в качестве контроля положительные и
отрицательные отпечатки тканей, раздавленные или чистые культуры (в виде
роста бактерий или в суспензии) соответственно.
Дайте отпечаткам ткани, раздавленным частицам, колониальным точкам
или кляксам высохнуть в течение не менее 10 минут при комнатной
температуре. Отпечатанные или промокнутые мембраны могут храниться в
темноте при комнатной температуре в течение длительного времени (более
одного года) и достаточно долговечны, чтобы быть отправленными, например,
в другую лабораторию.
266
Заблокируйте нитроцеллюлозную мембрану с помощью раствора 1%
бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS pH 7,2. Добавьте достаточное
количество раствора, чтобы покрыть мембрану в соответствующем
контейнере. Этап блокировки можно проводить в течение ночи при
температуре 4°C в течение 1 часа при комнатной температуре. Удалите раствор
BSA без промывки.
Приготовьте соответствующее разведение конъюгированных со
щелочной фосфатазой специфических антител в PBS 0,01 М, рН 7,2. Добавьте
достаточное количество раствора для покрытия мембраны в соответствующий
контейнер. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре при
легком перемешивании (100 об / мин).
Удалите конъюгат и затем трижды промойте мембрану PBS-Tween или
другим подходящим буфером с 5-минутными шагами промывки при
встряхивании (100 об / мин).
Приготовьте раствор осаждающего субстрата для щелочной фосфатазы
(например, NBT + BCIP в буфере субстрата или дистиллированной воде, следуя
рекомендациям поставщика. Накройте мембрану этим раствором в
соответствующей емкости и инкубируйте при комнатной температуре в
течение 10-15 минут. Остановите реакцию, промыв ее под водопроводной
водой, высушите на фильтровальной бумаге и наблюдайте окончательные
фиолетово-фиолетовые осадки с помощью стереомикроскопа с низким
увеличением (×5) или увеличительного стекла.
30.4.7. Обнаружение Xanthomonas campestris pv. campestris через ELISA
Необходимый материал
Антиген: Антиген должен быть приготовлен из культуры Xcc.
Носители: эритроциты овец (SRBC).
Консервант: раствор Альсевера (цитратный физиологический раствор).
Антисыворотка.
Реагент для ИФА. Буфер покрытия: 0,05 М карбонатно–бикарбонатный
буфер (рН 9,6); PBS (рН 7,4); промывочный буфер; блокирующий реагент
267
(PBS, содержащий 5% (w/v) обезжиренного молока); реагенты для конъюгатов
щелочной фосфатазы; субстратный буфер; реагент для конъюгатов
пероксидазы хрена.
Субстраты: субстрат AP, субстрат HRPO.
Антигенный препарат
Выделите бактерию из сильно инфицированных листьев цветной
капусты, инкубируя поверхностно стерилизованные образцы листьев на
пластинах питательного агара (NA) в течение 48-72 часов при температуре
27°C. Отдельные колонии, появляющиеся желтыми и слизистыми, отбираются
и многократно субкультурируются для чистых колоний и подвергаются
подтверждающим тестам, таким как патогенность, гиперчувствительность и
биохимические тесты. Культивируют Xcc на питательном бульоне в
статических условиях в течение 48 часов при температуре 27°С и собирают
центрифугированием при 3000 об / мин в течение 10 минут; клетки
суспендируют в 20 ммоль 1-1 фосфатно-буферного физиологического раствора
(PBS; рН 7,4) и эти интактные целые клетки промывают три раза в одном и том
же буфере и используют в качестве антигена для иммунизации и для ИФА.
Эритроциты овец (SRBC) как носители: Как углеводы, так и белковый
антиген могут быть легко адсорбированы на эритроцитах корабля, чтобы
сделать их агглютинируемыми с антисывороткой, специфичной для
“дополнительных” антигенов. SRBC можно легко использовать в качестве
носителя для очищенных углеводных антигенов, которые сами по себе обычно
не очень иммуногенны у кроликов (Diano et al., 1987). При обработке SRBC
0,005-процентной дубильной кислотой низкомолекулярные белковые
антигены также могут быть адсорбированы.
Прикрепление сырого липополисахарида (ЛПС) к SRBC:
1. Кипятите ночную культуру грамотрицательных бактерий в течение 1
часа; центрифугируйте ее при 2000 об / мин в течение 10 минут для осаждения
остатков клеток. Супернатант содержит сырой экстракт антигена ЛПС.
268
2. Смешайте 4,5 мл экстракта бактериальных супернатантов с 6 мл 2,5процентного SRBC в соотношении бактериальный экстрагент-SRBC 3:4 (v/v).
Для всех манипуляций с суспензией SRBC следует использовать
изотонические растворы, такие как фосфатный буферный физиологический
раствор (PBS) или раствор Alserver. Инкубируйте в течение 30 минут с
периодическим встряхиванием.
3. Осадите SRBC центрифугированием при 200 × g в течение 10 минут и
дважды промойте клетку 10 мл физиологического раствора или
изотонического буфера.
4. Ресуспендируйте гранулу с 6 мл PBS. Теперь суспензия готова к
инъекции.
Раствор Алсевера (цитратный физиологический раствор): Раствор Алсевераэто изотонический антикоагулянтный консервант крови, который позволяет
хранить цельную кровь при охлажденной температуре в течение 10 недель и
более.
Дубление SRBC для покрытия белковыми антигенами:
1. Добавьте 3 мл 0,005% дубильной кислоты в центрифужную пробирку,
содержащую 3 мл 2,5% SRBC. Инкубировать при температуре 37°C в течение
10 минут.
2. Центрифугируйте клетки при 2000 об / мин в течение 10 минут и
промойте один раз в 5 мл PBS. Центрифугируйте, как и раньше, и
ресуспендируйте гранулу в 3 мл PBS.
269
3. К каждой центрифужной пробирке, содержащей 3 мл дубленого SRBC
и 3 мл 0,3 мг/мл растворимого белка, аккуратно перемешать и инкубировать
при 37°C в течение 15 минут.
4. Центрифугируйте и промойте дважды, как указано выше.
Ресуспендируйте каждую таблетку в 3 мл разбавителей PBS. Теперь эти клетки
готовы к инъекции.
Бактериальные клетки как носители: Бактериальные гладкие ЛПС,
содержащие О-антигенные сахара, чрезвычайно иммуногенны, в то время как
часто бывает трудно поднять антитела к олигосахаридному эпитопу ЛПС-ядра
грамотрицательного организма. Чтобы вызвать ответ на эпитоп области ядра,
антигены, такие как чистый олигосахарид, липид А или грубый ЛПС, могут
быть прикреплены к бактериальным клеткам грубого штамма.
1. Приготовьте 5 × 109 кое/мл термически убитых клеток грубого мутанта
на мл 1% (v/v) уксусной кислоты.
2. Нагрейте суспензию клеток до 100°C в течение 1 часа.
3. Промойте три раза в дистиллированной воде.
4. Лиофилизировать.
5. Растворите липид А или грубый ЛПС в 0,5% (v/v) триэтиламиде в
концентрации 1 мг/мл; затем добавьте лиофилизованные обработанные
кислотой бактерии до конечной концентрации 1 мг/мл.
6. Медленно перемешивайте в течение 30 минут при комнатной
температуре.
7. Обезвоживайте смесь в вакууме с помощью центрифуги speed-vac.
Выработка антисыворотки: Циркулирующие антитела против
специфического антигена не появляются в значительных количествах по
крайней мере до 7 дней после иммунизации. Большинство антител раннего
(или первичного) ответа относятся к классу иммуноглобулинов М (IgM), тогда
как антитела последнего (вторичного) ответа в основном являются IgG.
Однако, если используемый антиген является чистым углеводом, вторичным
ответом будет в основном IgM. Количество антител, образующихся после
270
второй или бустерной инъекции любого данного антигена, обычно намного
больше, чем образуется после первой инъекции. Поэтому для получения
антител с высоким титром можно использовать следующий график для
кролика.
1. Поднять антитело у 3-месячной самки кролика-альбиноса.
2. Соберите предварительно иммунную сыворотку (перед первой
инъекцией) для использования в качестве контроля для обнаружения
перекрестно-реактивных антител.
3. Смешанные бактериальные клетки (105 мл−1) в пропорции 1:1 с
полным адъювантом Фрейнда (Robinson et al., 1996).
4. Подкожно ввести 0,1 мл клеток (1 × 104 мл−1), составляющих
примерно 100 мкг белка, в четыре участка.
5. На 4-й день повторите шаги инъекции 1-го дня, но с неполным
адъювантом Фрейнда. После этого дайте животному отдохнуть в течение 14
дней, чтобы первичная реакция снизилась до уровня базовой линии, в
противном случае вторичная реакция может быть не достигнута.
6. На 18-й день внутримышечно ввести 1,0 мл (смесь белковых антигенов
1:1 с неполным адъювантом Фрейнда) в мышцу бедра одной ноги животного.
7. На 22-й день кровотечение и сбор сыворотки.
8. На 25-й день повторите описанный выше этап внутримышечного
введения на другую ногу животного.
9. На 29-й день кровопускание и сбор сыворотки, а также объединение
сыворотки с предыдущим образцом.
Внутримышечные инъекции можно проводить один раз в месяц или один
раз в 2 недели, а сыворотку можно собирать через 3-4 дня. Чтобы избежать
вариабельности от партии к партии, иммунные сыворотки, собранные в разное
время, должны быть объединены. На некоторых этапах могут быть сделаны
изменения; например, внутривенная инъекция без адъюванта может быть дана
в качестве бустера (на 18-й и 25-й дни), чтобы вызвать более быстрый ответ
перед кровотечением для сбора антител.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]