Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
271
Сбор сыворотки: Кровь следует собирать в сухой стерильный контейнер
без какого-либо коагулянта. Обычно кровь выводится из краевой вены ушей
животного. Небольшой разрез (поверхностный венозный разрез) расширенной
вены кончиком свежего лезвия скальпеля вскроет ее. Капельки крови, которые
появляются, собираются в подходящую емкость, обычно стеклянную бутылку
с крышкой. При достаточной практике можно легко получить 20-30 мл крови.
Кровь, взятую у животных, следует дать сгуститься при комнатной
температуре в течение 30 минут. Затем его можно держать при температуре
37°C еще 30 минут. Затем сыворотку можно отделить и центрифугировать,
чтобы избавиться от всех клеток крови. В качестве альтернативы кровь можно
держать для свертывания при температуре 4°C в течение ночи до полного
сморщивания сгустка перед удалением сыворотки. Последняя процедура даст
больше сыворотки на мл крови и сохранит антитела от гидролиза под
действием естественных IgG-протеаз.
Протокол ИФА (Joseph and Mutharia, 1994)
Антигенное покрытие или адсорбция: Сделайте несколько разведений
антигена в буфере покрытия в концентрациях от 10 до 100 мкг/мл для сложных
антигенов. Очень хорошо перемешать. Распределяют в трех экземплярах по
вертикальным рядам, по 50-100 мкл каждого разведения антигена на лунку.
Накройте пластинки пластиковой пищевой пленкой (например, Саранской или
стрейч-и-пломбой) и инкубируйте при температуре 4°С в течение 16 часов,
адсорбция антигенов на матрице увеличивается со временем экспозиции.
Добавьте соответствующие ингибиторы протеаз в буфер покрытия, когда
протеазы подозреваются в антигенных препаратах. В качестве альтернативы,
если антитело реагирует с денатурированными антигенами, кипятите образцы
перед адсорбцией.
Промывание: Вытряхните раствор из лунки сильным движением кисти.
Мойте тарелки, направляя струю промывочного буфера из промывочной
бутылки в каждую лунку. Промыть три раза PBS-Tween, инкубируя каждый раз
272
в течение 5 минут. Смойте водой PBS. Вытряхните весь буфер между каждой
стиркой.
Блокировка: Добавьте 200 мкл 5-процентного обезжиренного молока в
каждую лунку. Инкубировать 2 часа при температуре 37°С или 4 часа при
комнатной температуре. Промыть три раза PBS без инкубации.
Тестируемое антитело: Приготовьте разведения тестируемого антитела в
2% (w/v) обезжиренном молоке и добавьте в лунки, покрытые антигеном (в
объеме, равном объему антигена). Как правило, используют первичные
иммунные сыворотки в разведении 1:10 и гипериммунные сыворотки в
разведениях от 1:100 до 1:1500 или выше. Аликвота сыворотки в
горизонтальных рядах такова, что каждое разведение сыворотки тестируется
против всех разведений антигена, то есть происходит шахматное титрование.
Инкубируйте, как в шаге 2, и повторите промывки.
Второе антитело: Разведите меченое (конъюгированное) второе антитело
в 2-процентном обезжиренном молоке. Повторите инкубацию и промывание.
Субстрат: Подготовьте соответствующие субстраты для используемого
конъюгата и добавьте в лунки в объемах, равных объему покрывающего
антигена. Инкубируйте пластины при 37°C и снимайте показания (при
соответствующей длине волны для подложки) в течение 30, 45 и 60 минут.
Анализ данных: Постройте график процентного поглощения
(рассчитанного в процентах от максимального значения) по отношению к
концентрации антигена. Из графика вычислите самую низкую концентрацию
антигена, которая даст 50 процентов от максимального значения для данного
момента времени. Это концентрация антигена, которую следует использовать
для последующего ИФА. Титр антител при этой концентрации антигена затем
может быть использован для положительного контроля.
Примечания: Важно, чтобы каждая пластина содержала следующие
контрольные скважины:
Антигенный бланк
Первый бланк антитела
273
Гомологичный и неродственный контроль антигенов
Антиген-дефицитный контроль используется для обнуления считывателя
пластин. Шахматный ИФА также может быть использован для установления
оптимальных концентраций конъюгатов и антител. В каждом анализе
одновременно изменяется только один параметр. Инкубацию также можно
проводить при температуре 37°C в течение 2 часов или при комнатной
температуре в течение 4 часов.
Реагент для ИФА
1. Буфер покрытия: 0,05 М карбонатно–бикарбонатный буфер (рН 9,6)
Для приготовления рабочего буфера смешивают 20 мл раствора А и 42,5
мл раствора В и доводят до 250 мл дистиллированной водой. рН должен быть
9,6. Добавьте 0,05 г NaN3. Хранить при температуре 4°C в темной бутылке до
4 недель.
2. PBS (pH 7,4):
Рабочий буфер готовят следующим образом: смешивают 47,50 мл
раствора А и 202,50 мл раствора В; доводят до 800 мл дистиллированной водой.
Добавьте 8,75 г NaCl и доведите до 1000 мл. рН должен быть 7,4.
3. Промывочный буфер: PBS, содержащий 0,05% Твина 20.
4. Блокирующий реагент: PBS, содержащий 5% (w/v) обезжиренного
молока. Это должно быть свежим каждый день.
5. Реагенты для конъюгатов щелочной фосфатазы:
Субстратный буфер: карбонат натрия (0,05 М; рН 9,8), содержащий 10
мм MgCl2. Для подготовки буфера подложки используйте буферные запасы,
274
сделанные для буфера покрытия (шаг 1). Смешайте 27,5 мл раствора А с 35 мл
раствора В и доведите до 250 мл дистиллированной воды. Добавьте 0,05 г
MgCl2.2H2O. Проверьте рН перед использованием. Хранить в темной бутылке
при температуре 4°C.
В качестве альтернативы используют 1 М диэтаноламиновый буфер рН
9,8, содержащий 0,5 мМ MgCl2.
Субстрат АП: Растворить в буфере 1 мг п-нитрофенилфосфата на мл.
Субстрат можно получить из Сигмы в виде таблеток по 5 мг. Хранить
подложки при температуре 20°C.
Считайте желтый цвет при 414 нм. Развитие окраски можно остановить
добавлением в лунки 10 мкл 3 М NaOH.
6. Реагент для конъюгатов пероксидазы хрена:
Буфер субстрата: Приготовьте буфер лимонной кислоты (рН 4,0),
растворив 0,2 г лимонной кислоты в 90 мл дистиллированной воды.
Отрегулируйте рН 4,0 с помощью 1 М NaOH. Хранить при комнатной
температуре.
Субстрат HRPO: Непосредственно перед использованием добавьте к 10
мл буфера лимонной кислоты 5 мкл 30-процентной H2O2 и 75 мкл 10 мг/мл
[2,2-азино-бис (этилбензтиазолин) - 6 - сульфокислоты. Считайте зеленый цвет
при 414 нм. Развитие цвета может быть остановлено добавлением 0,08 М NaF
в скважины.
30.4.8. Определение антигенной детерминанты бактериального
патогена методом иммуноблот-анализа
Поскольку Xcc положителен и специфичен в реактивности ELISA,
проводится иммуноблот-анализ для идентификации антигенной
детерминантной молекулы в патогене.
Необходимый материал
275
Нитроцеллюлозная бумага, PAb, Xcc, конъюгированный со щелочной
фосфатазой хромогенный субстрат IgG свиньи против кролика (5-Бром-4-хлор3-индолилфосфат), щелочная фосфатаза.
Методика
Равное количество бактериальных клеток должно быть загружено в двух
экземплярах на 12-процентную SDS-СТРАНИЦУ в мини-гелевом аппарате
(Genei Pvt, Бангалор, Индия). После электрофореза первую половину с
маркерными белками окрашивают серебром для визуализации белковых полос,
а вторую половину геля переносят на нитроцеллюлозную мембрану.
Нитроцеллюлозную бумагу следует зондировать 1:500 PAb-Xcc, а затем 1:1000
конъюгированной щелочной фосфатазой свиньи против кролика 1gG. В
качестве хромогенного субстрата используется 5-бром-4-хлор3индолилфосфат, который по активности щелочной фосфатазы дает
восстановленный, стабильный комплекс фиолетового цвета с полосой,
специфически реагирующий с PAb-Xcc.
Очистка PAb-Xcc методом колоночной хроматографии Sepharcryl-200-
HR
Осаждают антисыворотку 50-процентным (w/v) сульфатом аммония и
загружают на дегазированную колонку, упакованную Сефакрилом-200-Ч (65 ×
1,0 см), фракции 1 мл собирают со скоростью потока 18 мл ч-1 и контролируют
фракции спектрофотометрически при А280 нм (U−2000; Shimadzu, Япония).
Последующие пиковые фракции объединяются в виде пика 1, PlAb-Xcc и Пика
2, P2AB-Xcc, и исследуются на реактивность антител методом ИФА. После
лиофилизации их оценивают на титр антител, чувствительность и обнаружение
клеток, а также фильтратов культуры. Сырое антитело также включено в
эксперимент. Готовятся соответствующие средства контроля, такие как
обнаружение с помощью преиммунной сыворотки и нерелевантных
ксантомнад. Эти два пика показывают дифференциальную реактивность с
вирулентными и авирулентными изолятами в ИФА.
276
30.5. Использование специфического иммуноглобулина при
иммунофлуоресценции для выявления скрытой инфекции
Процедура, описанная Borkar et al. (1989c), относится к штамму
Xanthomonas corylina K-100 и выглядит следующим образом:
1. Приготовление антигенного гликопротеина: Используйте тестбактерию для приготовления антигенного гликопротеина. Приготовьте
антигенный гликопротеин тестируемой бактерии, как описано в предыдущем
упражнении.
2. Производство и извлечение иммуноглобулина: Выполните
производство и извлечение иммуноглобулина, как описано ранее. Соблюдайте
график иммунизации в течение девяти недель для получения и извлечения
иммуноглобулина. Оценить наличие эффективного содержания
иммуноглобулинов в антисыворотке непрямым методом
иммунофлуоресценции для данной/тестируемой бактерии, как описано ранее.
3. Извлечение бактериоспецифического иммуноглобулина сродством.
Хроматография: Три мл раствора антигенного гликопротеина (4,5 мг белка/мл)
исследуемой бактерии доводят до рН 8 1 М буфером Na2HPO4 (1 М Na2HPO4,
483 мл + 1 М NaH2PO4, 17 мл = рН 8 буфера) и смешивают с 0,8 мл раствора
п-бензохинона (30 мг/мл в абсолютном холодном спирте). Эту смесь
перемешивают для активации в темной камере при температуре 4°С в течение
1 часа. Активированный гликопротеин трижды осаждают 6 мл холодного
этанола (путем последующего центрифугирования при 4000 об / мин в течение
8 минут). Осажденный гликопротеин растворяют в 8 мл NaHCO3 (0,1 М, рН
8,2) и смешивают с 4 г геля сафроза 6 В в течение ночи при 4°С на мешалке.
Поместите эту смесь в колонну (Б. П. 16 мм × 130). Заполненную колонку
промывают 0,1 М NA2HPO4 буфером рН 7 (161 мл Na2HPO4 (0,5 М) + 89 мл
NaH2PO4 (0,5 М) и добавляют сверхчистую воду до получения объема 11,
чтобы получить рН 7,0) для регулировки рН (7,0) гликопротеина в колонке.
Колонку дополнительно промывают HCl–глицериновым буфером рН 2,7 (HCl
0,1 Н, 700 мл + глицерин, 300 мл (15,014 г/1)) для удаления нефиксированного
277
гликопротеина (требуется 3 об. HCl–глицеринового буфера со скоростью 25
мл/час регулятора расхода для удаления нефиксированного гликопротеина).
Нефиксированный гликопротеин собирают во время промывки колонки двумя
буферами. После сбора нефиксированного гликопротеина рН колонки доводят
до 7 (с 0,01 М буфером Na2HPO4) и пропускают в гель 3 мл антисыворотки
исследуемой бактерии для фиксации специфического иммуноглобулина к
фиксированному гликопротеину в геле. Гель промывают 0,01 М буфером
Na2HPO4 (рН 7) для элюирования неспецифического нефиксированного
иммуноглобулина. Когда пик нефиксированного иммуноглобулина
заканчивается, кулона промывают HCl–глицериновым буфером (рН 2,5) для
элюирования специфических фиксированных иммуноглобулинов.
Специфические иммуноглобулины собирают в 1 м растворе K2HPO4 (рН 7),
чтобы избежать денатурации (обычно требуется 3 мл раствора K2HPO4 на 2 мл
раствора иммуноглобулина, собранного из колонки). рН иммуноглобулина
доводят до рН 7 с помощью 0.01Mp.Na/Na2 буфер. Этот раствор
иммуноглобулина концентрируют путем погружения диализной трубки,
содержащей специфический иммуноглобулин, в 20-процентный
полиэтиленгликоль (обычно 2 часа достаточно для поглощения 10 мл воды из
диализной трубки), а белок оценивают методом УФ-абсорбции при 280 нм из
концентрированного раствора специфического иммуноглобулина.
4. Определение специфических иммуноглобулинов и их эффективное
разведение для использования при выявлении скрытой инфекции: Производят
серийное разведение логарифмической суспензии (107 К. Ф. Ед/мл)
исследуемой бактерии. Добавьте 10 мкл суспензии каждого разведения (от 102 до 10-7) в лунку иммунофлуоресцентного слайда и высушите при
температуре 26°C. Это фиксируется спиртом в течение 10 минут. Добавьте 10
мкл специфического иммуноглобулина различного разведения (от 1/100 до
1/6400) отдельно в каждую лунку и дайте прореагировать в течение 30 минут.
Избыток иммуноглобулина дважды заливают фосфатным буфером (NaCl, 8 г;
Na2HPO4, 2,7 г; NaH2PO4, 2,4 г; дистиллированная вода, 1,1; рН 7,2) по 5
278
минут каждая. Добавьте 10 мкл конъюгированного флуоресцеином козьего
анти-кроличьего иммуноглобулина в разведении 1/300 в каждую лунку и дайте
прореагировать в течение 30 минут. Удалите избыток конъюгированного
флуоресцеина, промыв предметное стекло фосфатным буфером трижды в
течение 3 минут и высушите промокательной бумагой. Добавьте каплю
глицеринового буфера на предметное стекло и наблюдайте при погружении
масла в свет иммунофлуоресценции.
5. Выявление скрытой инфекции тест-бактерии из здоровых
почек/листьев растения-хозяина с помощью специфического
иммуноглобулина: Делают отбор проб из здоровых почек, молодых листьев и
веточек от естественного хозяина тест-бактерии. Мацерат по 25 г пробы
каждого в 250 мл дистиллированной воды и центрифугируют при 4000 об / мин
в течение 20 минут. Соберите супернатант и отфильтруйте через
фильтровальную бумагу Whatman no. 42. Соберите фильтрат и сделайте
последовательное разбавление. Помещают 10 мкл раствора последовательного
разведения (от 10-2 до 10-7) каждого образца отдельно в лунку
иммунофлуоресцентного предметного стекла и сушат при температуре 26°С.
Это фиксируется спиртом в течение 10 мин. Добавьте 10 мкл специфического
иммуноглобулина разведения 1/400 в каждую лунку и дайте прореагировать в
течение 30 мин. Избыток иммуноглобулина дважды заливают фосфатным
буфером по 5 минут каждый. Добавьте 10 мкл конъюгированного
флуоресцеином козьего анти-кроличьего иммуноглобулина в разведении 1/300
в каждую лунку и дайте прореагировать в течение 30 минут. Избыток
конъюгированного флуоресцеина удаляют, промывая предметное стекло
фосфатным буфером трижды в течение 3 минут и высушивая промокательной
бумагой. Добавьте каплю глицеринового буфера на предметное стекло и
наблюдайте при погружении масла в свет иммунофлуоресценции.
279
31. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ
МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ
Идентификация различных штаммов растительных патогенов
традиционно основывалась на микроскопическом исследовании
морфологических и биохимических признаков и ростовых характеристик
патогена на конкретных средах. Различия в морфологических признаках
существуют и приводят к трудностям точной идентификации традиционными
методами. Кроме того, идентификация на основе анализа патогенности или
характеристик роста занимает много времени. Точная и быстрая
характеристика важна для точной диагностики родственных патогенов
растений и понимания структуры популяции и генетики патогена по
нескольким причинам.
Молекулярные маркеры, с другой стороны, очень надежны для
каталогизации изменчивости патогенов растений, поскольку они не связаны с
биологически важными характеристиками. Молекулярные методы также
использовались для изучения генетического разнообразия и эволюционного
происхождения популяций многих различных родов. Молекулярное
обнаружение может генерировать быстрые точные результаты, достаточно
полезные для решения по управлению болезнями.
В растительных патогенных бактериях вариация выходит на
молекулярном или генетическом уровне в самом данном патогене, и поэтому
расы выходят в данном патогене бактерии, которые не могут быть
идентифицированы культурными, физиологическими или биохимическими
характеристиками. Чтобы узнать эту изменчивость, молекулярные методы
являются наиболее важными и подходящими инструментами. Знание
патогенной изменчивости важно для развития устойчивых к этому патогену
сортов сельскохозяйственных культур. Для изучения молекулярной
изменчивости обычно используются молекулярные методы, такие как методы,
основанные на гибридизации, методы, основанные на ПЦР, и методы,
280
основанные на соотношении гуанин-плюс-цитозин. В этой главе
рассматриваются все эти методы наряду с другими молекулярными методами,
которые могут быть использованы при изучении патогенных бактерий
растений.
31.1. Выделение бактериальной ДНК
31.1.1. Выделение бактериальной геномной ДНК
Необходимый материал
Тест-бактерия, додецилсульфат натрия, протеиназа–к, раствор CTABNaCl, хлороформ, изоамиловый спирт, фенол, изопропанол, этанол, ТЕ-масло,
центрифуга и так далее.
Методика
Центрифугируйте бактериальную культуру при 5000 об / мин в течение
5 минут при комнатной температуре. Соберите гранулу, полностью отбросив
питательную среду. Добавьте 10% додецилсульфата натрия и 20 мг/мл
протеиназы-К до конечной концентрации 10 мкг/мл протеиназы-К в 0,5% SDS.
Тщательно перемешайте и инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37°C.
Добавьте 2,5 объема раствора CTAB–NaCl. Тщательно перемешайте и
инкубируйте в течение 10 минут при температуре 65°C. Добавьте примерно
равный объем хлороформа: изоамиловый спирт (смешанный в равном
соотношении), тщательно перемешайте и отжимайте в течение 5 минут в
микроцентрифуге при комнатной температуре. Соберите водную фазу в
свежую микроцентрифужную пробирку. Добавьте равный объем фенола:
хлороформ: изоамиловый спирт (в соотношении 25:24:1) и вращайте в течение
5 минут.
Перенесите супернатант в свежую пробирку и добавьте 0,7 объема
изопропанола для осаждения геномной ДНК. Вращайте его в течение 10 минут
при комнатной температуре. Промойте ДНК охлажденным 70 - процентным
этанолом, чтобы удалить остаточные соли, и снова вращайте в течение 2 минут
при комнатной температуре, не нарушая гранулу. Повторно растворите
гранулу в подходящем объеме ТЕ-буфера (10 мм ТРИС + 1 мм ЭДТА) или
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]