Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
321
Риботипирование включает в себя дактилоскопирование
рестрикционных фрагментов, содержащих все или часть генов, кодирующих
16S и 23S рРНК. Полиморфизм риботипов является результатом
вариабельности последовательностей нейтральных генов, фланкирующих
опероны рРНК, причем последовательности генов рРНК служат
исключительно в качестве консервативных фланкированных меток. Как
показано на рис. 31.5, традиционное риботипирование основано на
рестрикционном расщеплении общей геномной ДНК с последующим
электрофоретическим разделением, переносом Саутерн-блота и
гибридизацией перенесенных фрагментов ДНК с меченым рибосомальным
оперонным зондом. После ауторадиографии визуализируются только те
полосы, которые содержат часть рибосомного оперона. Он образует
уникальный узор для каждого вида и может быть использован, почти как
штрих-код. Обоснования для применения риботипической дифференциации
независимых изолятов внутри вида включали таксономическую
классификацию, эпидемиологическое отслеживание, географическое
распределение.
Праймеры: 5'-GTGCGGCTGGATCACCTCCT-3' (16S праймер) и 5'CCCTGCACCCTTAATAACTTGACC-3' (23S праймер) и соответствовали
основаниям 1482-1501 гена 16S рибосомной РНК и основаниям 1-24 гена 23S
рибосомной РНК.
Методика
Реакции амплификации проводят в объеме 100 мкл, содержащем 10 мм
Трис-HCl (рН 8,8), 50 мМ KCl, 1,5 мм MgCl2, 200 мкм каждого dNTP, 50 пмоль
каждого праймера, 2,5 единицы Taq-полимеразы и 10 мкл экстракта ДНК (или
дистиллированной воды в качестве отрицательного контроля). Сравнение
проводят с добавлением и без добавления 5% ДМСО (диметилсульфоксида) в
реакционную смесь. Амплификацию проводят в термоциклере (Perkin Elmer
Cetus 480) в течение 1 цикла 6 минут при 94°C для денатурации, затем 35
циклов (1 минута при 94°C, 1 минута при 57°C и 1 минута при 72°C) и
322
окончательное продление 7 минут при 72°C. Фракционируйте продукты
амплификации с помощью 3-процентного электрофореза агарозы Metaphor ™
в течение 6 часов при 80 В в TBE после окрашивания бромистым этидием.
Гелевые изображения получают с помощью ПЗС-камеры и анализируют.
Воспроизводимость изучается повторными ПЦР-анализами одного и того же
экстракта ДНК.
31.6.2. Секвенирование 16S рРНК
16s-рибосомная РНК является компонентом меньшей субъединицы
прокариотических рибосом. Ключевым маркером в диагностике бактерий
является ген 16S рРНК, так как он присутствует у всех бактерий и кодирует
один и тот же продукт. Благодаря консервативности своей генной
последовательности он широко используется на таксономическом уровне для
видовой идентификации изолятов. Филогения может быть определена на
основе различий нуклеиновых кислот, которые могут быть достаточными для
идентификации видов. секвенирование генов 16s рРНК обеспечивает
идентификацию на уровне рода и вида изолятов, которые не соответствуют
никаким признанным биохимическим профилям штаммов, генерирующих
только низкую вероятность или приемлемую идентификацию в соответствии с
коммерческими системами.
Методика
Для ПЦР-амплификации используются универсальные 16s-специфичные
праймеры генов рРНК. В качестве матрицы для ПЦР используется
эквимолярная рабочая концентрация 40-100 нг/мкл. ПЦР-амплификационную
смесь (20-50 мкл) готовят на льду в 0,2 мл путем добавления 1 единицы Taq
ДНК-полимеразы, ее 1× буфера, dNTP-смеси, MgCl2 (при отсутствии в буфере)
по 10 пикомолей каждого праймера и ~40-100 нг матричной ДНК, а также воды
для получения конечного объема (20-50 мкл). ПЦР-пробирки помещают в
термоциклер, ПЦР-амплификацию проводят путем программирования
теплового режима в виде начальной денатурации: 94°С в течение 5 мин с
последующим 40 циклами каждой денатурации (94°С); отжига (58°С) и
323
удлинения (72°С). Затем следует окончательное удержание расширения при
72°C в течение 5 мин, чтобы обеспечить полное расширение продукта ПЦР.
Амплифицированная ДНК очищается для удаления свободных праймеров и
нуклеотидов из реакции ПЦР. Он может быть специально секвенирован на
платной основе с использованием универсальных праймеров, которые
используются для ПЦР-амплификации с обеих сторон. Последовательность
анализируется на наличие ошибок, если таковые имеются, и подвергается
поиску гомологии с ранее сообщенной последовательностью с помощью
программы Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), доступной по адресу
ncbi.nlm.nih.gov. BLAST-это веб-программа, которая способна выровнять
последовательность поиска по тысячам различных последовательностей в базе
данных (которую вы выбираете) и показать список лучших совпадений. Эта
программа может искать в базе данных тысячи записей в минуту.
31.6.3. Секвенирование внутренней транскрибированной спейсерной
(ITS) рРНК
Гены ядерной малой субъединицы рРНК эволюционируют относительно
медленно и полезны для изучения отчетливо родственных организмов, в то
время как ЕЕ регионы и межгенные повторы эволюционируют быстрее и могут
варьировать среди видов и популяций (White et al., 1990). Новые данные
добавляются в международные базы данных ДНК с экспоненциальной
скоростью, но уже существует около тысячи последовательностей для хорошо
изученной области ЕГО ДНК. Амплификация ITS-рРНК сочетается с
расщеплением концевой нуклеазы рестрикции для идентификации видов и
дальнейшей разработки видоспецифичных праймеров (Ristaino et al., 1998).
Методика
Универсальные ЕГО рРНК-специфические праймеры используются для
ПЦР-амплификации. Остальные этапы аналогичны секвенированию 16S рРНК.
324
31.7. Метод терминального рестрикционного фрагмента паттерна (TRFP)
Полиморфизм длины терминального рестрикционного фрагмента
(TRFLP или иногда T-RFLP) - это метод дактилоскопии для профилирования
микробных сообществ. Он основан на нахождении положения участка
фермента рестрикции, ближайшего к флуоресцентно меченому концу
амплифицированного гена. Она включает в себя рестрикционное расщепление
ПЦР-амплифицированных вариантов одного гена и выявление полиморфизма
в размерах различных терминальных фрагментов с помощью лазерной
детекции на основе ДНК-генотипа. Этот метод был впервые описан Лю и его
коллегами в 1997 году, в котором использовалась амплификация гена 16S
рРНК из ДНК нескольких изолированных бактерий, а также образца
окружающей среды. Гены сообщества 16S рРНК амплифицируются и
флуоресцентно маркируются методом ПЦР. Меченые продукты
перевариваются ферментом рестрикции, а меченые терминальные
рестрикционные фрагменты (ТРФ) отделяются электрофорезом и
детектируются лазерно-индуцированной флуоресценцией на
автоматизированном генотипе/секвенсоре.
Когда мишенью ПЦР является 16S-рибосомная ДНК (рДНК), то паттерн
TRF отражает таксономическое разнообразие бактерий в образце. Анализ
паттернов TRF позволяет быстро контролировать окружающую среду во
времени и пространстве. Этот метод был использован для сравнения
бактериальных сообществ из разных сред. Сравнение паттернов ТРФ, взятых в
разное время, также может отслеживать временные изменения в структуре
бактериального сообщества.
Протокол создания TRF-паттернов для анализа
Каждый образец в 100 мг гомогенизируется путем распыления в жидком
азоте. ДНК извлекается из образца с помощью сверхчистого почвенного набора
ДНК по протоколу производителя. Амплифицируйте матричную ДНК с
325
помощью 5'-FAM-меченого праймера 46f (5'-FAMGCYTAACACATGCAAGTCGA) и немеченого праймера 536r (5'GTATTACCGCGGCTGCTGG). Проводят реакции в трех экземплярах со
следующими реагентами в реакционных смесях по 50 мкл: Темплатная ДНК10 нг; 1× ПЦР-буфер; дезоксинуклеозидтрифосфаты-0,6 мм; бычий
сывороточный альбумин-0,8 мкг/л; MgCl2 - 3,5 мм; 46f - 0,2 мкм; 536r-0,2 мкм;
Taq-ДНК-полимераза - 2 Мкм. Температура реакции и циклирование образцов
должны быть следующими: 94°C в течение 2 минут; 35 циклов 94°C в течение
2 минут; 48,5°C в течение 1 минуты; 72°C в течение 1 минуты; и один цикл
72°C в течение 10 минут. Очистите продукт ПЦР с помощью любого
подходящего набора для очистки ПЦР, чтобы удалить праймеры и
сконцентрировать образец. Флуоресцентно меченую ДНК (200 нг) разрезают
одним концевым ферментом нуклеазы рестрикции—MspI, DpnII или HaeIII
(2,0—4,0 Ед) - в рекомендуемых производителем реакционных буферах путем
инкубации реакционных смесей в течение 5 часов при 37°С, а затем
останавливают пищеварение, погружая в водяную баню при 65°С на 20 минут.
Этанол осаждает рестрикцию переваренной ДНК и растворяет ее в 18 мкл
формамида, по 1 мкл каждого из стандартов генного сканирования Rox 500 и
Rox 550-размера. ДНК денатурируют при 95°C в течение 5 минут и охлаждают
на льду. Образцы запускаются на автоматизированном анализаторе
генотипирования и количественно оценивают выход электроферограммы.
Выборочные данные состоят из размера (пары оснований) и площади пика для
каждого пика ТРФ в паттерне. Пиковый порог обнаружения нормализуется
путем создания искусственных порогов обнаружения для каждого образца.
31.8. Метод импульсного полевого гель-электрофореза (PFGE)
Импульсный полевой гель-электрофорез используется для разделения
молекул ДНК большого размера в геле путем приложения электрического
поля, которое периодически меняет направление. Стандартный метод гельэлектрофореза не способен отделить молекулы ДНК размером более 15-20 кб,
которые, по существу, движутся вместе в зависимости от размера. Шварц и
326
Кантор (1984) разработали метод PFGE, который расширил диапазон
разрешения для фрагментов ДНК на целых два порядка.
PFGE использует рестрикционные ферменты для переваривания
бактериальной геномной ДНК, чтобы генерировать небольшое количество
фрагментов ДНК, которые могут быть разделены в зависимости от размера.
Обычно эти рестрикционные фрагменты имеют большие размеры и нуждаются
в специальной обработке и разделении для получения отпечатка ДНК. Сначала
бактерии загружаются в агарозную суспензию, затем бактериальная клетка
лизируется для высвобождения геномной ДНК. Как только ДНК
высвобождается, суспензия агарозы и ДНК, также известная как пробка,
обрабатывается ферментами рестрикции. Обработанные пробки затем
загружают на агарозный гель, а рестрикционные фрагменты разделяют по
размеру с помощью электрического поля. Что отличает PFGE от того, как
ученые обычно разделяют ДНК, так это то, что PFGE может отделять
несколько больших рестрикционных фрагментов, постоянно изменяя
направление электрического поля, приложенного к гелю. Он считается
золотым стандартом, универсальным родовым методом бактериального
субтипирования патогенных организмов. Паттерны рестрикции ДНК,
генерируемые PFGE, стабильны и воспроизводимы.
Методика
Типирование методом импульсно-полевого гель-электрофореза (ПФГЭ)
использует рестрикционную переваренную хромосомную ДНК (от 5 до 20
фрагментов) различной длины примерно от 10 до 900 кб. Все изоляты получают
для ПФГЭ путем индивидуального суспендирования бактериальных клеток,
выращенных на культуральной среде при подходящей температуре инкубации,
в буфер клеточной суспензии (100 мМ Трис-HCl, 100 мм ЭДТА, рН 8,0) до
спектрометрического поглощения 0,7 ± 0,05 при 612 нм. Протеиназу К (20 мкл)
добавляют к 400 мкл бактериальной суспензии вместе с 400 мкл
расплавленного (54°С) 1% - ного золотого агара SeaKem. Быстро перемешайте
и разлейте 300 мкл в подготовленные пробковые формы. После затвердевания
327
пробки помещают в 1,5 мл буфера лизиса клеток (50 мМ Трис-HCl, 50 мМ
ЭДТА, рН 8,0, 1% саркозила) и 40 мкл протеиназы К и инкубируют в течение
1,5 часа при температуре 54°С на встряхивающей водяной бане.
Дважды промойте пробки в сверхчистой воде в течение 15 минут на
водяной бане при температуре 50°C с последующей четырехкратной
промывкой в буфере Трис-ЭДТА (TE) (10 мм Трис-HCl, 1 мм ЭДТА, рН 8,0).
Храните промытые пробки в буфере TE при температуре 4°C. Для ПФГЭ
пробки разрезают на кусочки размером 3 мм на 9 мм и затем переваривают в
173 мкл стерильной воды, 2 мкл бычьего сывороточного альбумина, 20 мкл
буфера 10× XbaI и 5 мкл XbaI (10 Ед/мкл) при 37°С на встряхивающей водяной
бане в течение 1,5 часа. Пробки запускают в 1-процентном агарозном геле с
использованием системы импульсного поля CHEF III (Bio-Rad) в 0,5процентном Трис-борат-ЭДТА-буфере (Sigma) при температуре 10°C.
Параметры задаются с начальным временем переключения 2,2 секунды,
конечным временем переключения 64 секунды, напряжением 6 В/см и
длительностью 21 час. Гель окрашивают бромистым этидием и записывают
изображение на гелевую систему Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules,
California). Эти изображения файлов обрабатываются программным
обеспечением BioNumerics (Applied Maths BVBA, Kortrijk, Бельгия). Проверьте
изоляты внутри подтипа PFGE, которые имеют идентичные полосы, поэтому
один изолят из каждого подтипа PFGE случайным образом выбирается в
качестве репрезентативного, и кластерный анализ проводится по подтипам с
помощью коэффициента подобия кости и 0,8-процентных допусков положения
полосы, как это рекомендовано BioNumerics.
31.9. Анализ на основе гуанина и цитозина
Анализ на основе гуанина и цитозина-это прямой метод на основе ДНК
для первоначальной характеристики всего бактериального сообщества.
Молекулярный анализ на уровне сообществ на основе ДНК использовался для
получения информации о разнообразии, структуре и функциях микробных
сообществ. Высокоэффективная бактериальная экстракция и лизис помогают
328
восстановить ДНК, которая точно отражает бактериальные сообщества. Общие
образцы бактериальной ДНК фракционируются в соответствии с их
процентным содержанием G+C. Профили, отражающие состав бактериального
сообщества, были воспроизводимыми. Фракционирование общей ДНК
бактериального сообщества на основе процентного содержания G+C ранее
использовалось для анализа бактериальных сообществ и того, как они
реагируют на изменение условий в почвах и биореакторах. Анализ на основе
гуанина плюс цитозин также используется для идентификации группы или
вида в роде бактериального патогена растений.
Методика
1. Бактериальная экстракция: Образец (1 г) суспендируют в 30 мл
промывочного буфера и затем встряхивают в течение 10 минут на возвратнопоступательном горизонтальном платформенном шейкере с умеренной
скоростью при комнатной температуре. Полученную суспензию подвергают
центрифугированию при 30 000 × g в течение 15 минут для сбора
бактериальной фракции. Гранулу ресуспендировали и промывали еще три раза
в 30 мл свежего промывочного буфера, а образцы взвешенных бактерий
отбирали на каждом этапе для прямого микроскопического подсчета.
Микроскопический подсчет бактерий проводят с помощью флуоресцентной
микроскопии клеток, окрашенных DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндолом).
2. Бактериальный лизис и восстановление ДНК: Эффективный лизис
сложных смесей бактерий часто требует комбинации различных методов
лечения, которые, как известно, эффективны для лизиса отдельной
бактериальной популяции. Образцы бактериальных фракций (0,3 г образца
бактериальной гранулы и 0,7 г бактериальной гранулы) ресуспендируют в 3 мл
ТЕ-буфера (10 мм Трис [рН 8], 1 мм ЭДТА). Эти суспензии подвергают пяти
циклам замораживания-оттаивания инкубации при температуре -70°C в
течение 60 минут с последующим 40°C в течение 15 минут. Затем к каждому
образцу добавляют лизоцим в виде 0,7 мл исходного раствора 200 мг/мл (в
буфере TE) с последующей инкубацией при 37°C в течение 3 часов. После
329
добавления 0,2 мл додецилсульфата натрия (10% [мас./об.]) и 20 мкл раствора
протеиназы К (20 мг/мл в буфере TE) смесь инкубируют при 37°С в течение
дополнительного часа. После этой инкубации добавляют 0,72 мл 5 М NaCl, 0,6
мл 10% CTAB (гексадецилтриметиламмония бромида) в 0,7 М NaCl и 1 г
стеклянных шариков диаметром 1000 мкм (Sigma Chemical Company, СентЛуис, Миссури). Затем смеси инкубируют при температуре 65°C в течение 20
минут с завихрением в течение 30 секунд через каждые 5 минут. Образцы
суспендированной бактериальной фракции отбирают до и после лизиса для
оценки эффективности лизиса путем прямого микроскопического подсчета
бактерий. Клеточный лизат экстрагируют равным объемом хлороформизоамилового спирта (24:1) и затем подвергают центрифугированию при 6000
× г в течение 10 мин при комнатной температуре для разделения водной и
органической фаз. После переноса водной фазы в чистую центрифужную
пробирку ДНК осаждают путем добавления 0,6 объема изопропанола и
инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре. Осажденную ДНК
собирают центрифугированием при 10 000 × g в течение 15 минут при
комнатной температуре. Коротко промойте гранулу ДНК 70-процентным
этанолом, высушите ее в вакууме и растворите в 2 мл ТЕ-буфера. Очистите
извлеченную ДНК двумя раундами равновесного градиентного
центрифугирования хлорида цезия–бромида этидия. Полосы ДНК из этих
градиентов подвергаются экстракции бромистым этидием, обессоливанию и
осаждению этанолом для концентрирования ДНК. Концентрация и чистота
ДНК оцениваются на основе A260/280.
3. Процентные профили G+C дигестальных сообществ. Для получения
профиля бактериальных сообществ по процентному содержанию G+C 100 мкг
каждого образца ДНК подвергают градиентному анализу хлорида цезиябисбензимидазола. Поскольку в этих высокоочищенных препаратах ДНК нет
остаточного белка, количественное определение ДНК основано на А280, что
сводит к минимуму фоновое поглощение, возникающее в результате самого
градиента хлорида цезия и несвязанного бисбензимидазола. Определение
330
процентного содержания G + C, представленного каждой градиентной
фракцией, осуществляется путем регрессионного анализа (r2 > 0,99) данных,
полученных из градиентов, содержащих стандартные образцы ДНК известного
процентного состава G + C.
31.10. Проточная цитометрия для бактериальной диагностики
Проточная цитометрия основана на одновременной
многопараметрической оценке физико-химических свойств отдельных клеток,
протекающих через поток жидкости. Этот метод позволяет быстро
идентифицировать и количественно оценить тысячи клеток/частиц в секунду.
Мы можем измерять многочисленные свойства клеток (цитометрия), когда
клетки движутся в одном файле (потоке) в колонне жидкости и прерывают луч
лазерного света. Проточная цитометрия имеет применение для обнаружения
патогенных бактерий и вирусов растений, а также для оценки
жизнеспособности спор и бактерий (Bergervoet et al., 2007). Флуоресцентные
микросферы конъюгируются с различными антигенами/антителами, образуя
тем самым твердую фазу для обнаружения антител или антигенов в
биологических образцах. Эти частицы проходят индивидуально через датчик в
потоке жидкости, сортируются индивидуально и поэтому обнаруживаются.
Несколько параметров (относительный размер, гранулярность и до трех/девяти
цветов испускаемой флуоресценции) могут быть измерены одновременно и
коррелированы частица за частицей. Сигналы могут быть мгновенно собраны
в виде гистограмм для немедленных результатов или сохранены в виде
исходных данных для последующего экспериментального анализа. Различные
виды применения проточной цитометрии включают измерение
аутофлуоресцентных белков, содержания ДНК и РНК, плотности антигена или
лиганда, активности ферментов, мембранного потенциала, жизнеспособности,
полученной из клеток, изолированных ядер, органелл или микроорганизмов.
Эти анализы, по-видимому, более чувствительны, чем традиционные
иммуноанализы, обладают высокой пропускной способностью и обеспечивают
широкий аналитический динамический диапазон. Кроме того, они обладают
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]