Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
211
картофеля на две равные части и сделайте в центре клубня углубление с
пробковым сверлом. В одну срезанную часть клубня добавляют раствор
пектолитического фермента; в другую срезанную часть клубня добавляют
дистиллированную стерильную воду в качестве контроля. В другой срезанный
клубень картофеля добавить культурную суспензию Erwinia caratovora.
Инкубируйте все три нарезанных клубня в эксикаторах в течение 48 часов и
наблюдайте за развитием реакции.
Часть клубня с пектолитическими ферментами начинает распад клеток,
их размягчение и гниение, в то время как часть клубня со стерильной водой не
проявляет размягчения и гниения. Аналогично, часть клубня с бактериями
Erwinia также показывает размягчение и распад клеток, указывающих на
мацерацию тканей пектолитическим ферментом.
24.3. Бактериальные токсины в индукции реакции заболевания
Токсины могут воздействовать непосредственно на живые клетки
хозяина, повреждая или даже убивая хозяина, и участвуют в болезнях растений.
Некоторые токсины активны на широком спектре видов растений
(неспецифические токсины хозяина) или на конкретном виде хозяина
(специфический токсин хозяина).
Неспецифическими токсинами, продуцируемыми бактериальным
патогеном растений, являются табтоксин (продуцируемый Pseudomons syringae
pv. tabaci) и фазеолотоксин (продуцируемый P. syringae pv. phaseolicola).
Табтоксин индуцирует симптомы, идентичные симптомам, индуцируемым
патогеном Pseudomons syringae pv. tabaci, то есть некротические пятна,
окруженные желтым ореолом. Подобные эффекты могут наблюдаться на
различных хозяевах, что делает его не специфичным для хозяина токсином.
Табтоксин-химически дипептид, состоящий из аминокислот треонина и
табтоксинина. В клетке токсин tab расщепляется, высвобождая часть
табтоксинина, которая является активным токсином. Ингибирование фермента
глутаминсинтетазы является основным способом действия токсина. Точно так
же фазеолотоксин вызывал симптомы, сходные с симптомами патогена
212
Pseudomons syringae pv. phaseolicola. Химически это трипептид орнитина
аланина аргинина с фосфосульфинильной группой. Внутри клетки токсин
ферментативно расщепляется, высвобождая фосфосульфинилорнитин,
который является токсичным компонентом. В клетках он влияет на
инактивацию фермента орнитинкарбамолитрансферазы.
24.3.1. Исследования с фазеолотоксином pseudomonas
Необходимый материал
Раствор фазеолотоксина, восприимчивый бобовый хозяин, культура
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, дистиллированная стерильная вода,
инфильтрационный шприц.
Методика
Возьмите восприимчивое бобовое растение-хозяин к Pseudomons
syringae pv. phaseolicola с другими культурами. Приготовьте бактериальную
суспензию Pseudomons syringae pv. phaseolicola (108 кое мл) и инокулируйте
подкожным шприцем в дорсальную сторону листьев растения и пометьте их
соответствующим образом. Приготовьте раствор коммерческого
фазеолотоксина и инфильтрируйте его в листья хозяина и пометьте их
соответствующим образом. Инкубируйте растение при температуре 27 ± 2°С
для наблюдения симптомов до 5-7 дней.
Наблюдайте симптомы, вызванные фазеолотоксином на бобе и других
хозяевах в течение 12-24 часов, и их последующие изменения.
Наблюдайте симптомы, продуцируемые бактериальным патогеном
Pseudomons syringae pv. phaseolicola на фасоли и других хозяевах к 5-7 дням.
Сравните симптомы, вызываемые фазеолотоксином и бактерией Pseudomons
syringae pv. phaseolicola на фасоли и других хозяевах.
213
25. ПОДСЧЕТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ
Микробиологический анализ проб растений, почвы и воздуха требует
количественного определения, то есть общей популяции микроорганизмов в
этих субстратах. Плотность клеток микроорганизмов можно измерить в
лаборатории несколькими методами, либо прямым, либо косвенным
подсчетом. При прямом микроскопическом подсчете на предметное стекло
добавляют известный объем жидкости и подсчитывают количество
микроорганизмов, исследуя предметное стекло с помощью микроскопа яркого
поля. Для прямых микроскопических подсчетов используются счетная камера
Нойбауэра или Петроффа–Хауссера, мазки породы или электронный счетчик
клеток (например, счетчик Сошника). Различные методы косвенного подсчета
включают определение клеточной массы (определение сухого веса) или
клеточных компонентов (ДНК и белок), поглощение кислорода, производство
углекислого газа, мутные метрические измерения для увеличения числа клеток
(спектрофотометрический или колориметрический анализ), подсчет
мембранных фильтров и метод последовательного разбавления агаровой
пластины (подсчет пластин). За исключением двух последних методов,
которые используются для определения жизнеспособных клеток, основным
недостатком, общим для всех этих методов, является то, что общее количество
включает как мертвые, так и живые клетки. Двумя наиболее
распространенными косвенными методами являются подсчет пластин и
измерение мутности.
25.1. Подсчет (подсчет) бактерий методом пластинчатого подсчета или
методом последовательного разведения агаровых пластин
Метод подсчета пластинок является одной из наиболее часто
используемых процедур из-за подсчета жизнеспособных клеток с помощью
этого метода. Этот метод основан на принципе, что при культивировании
материала, содержащего бактерии, каждая жизнеспособная бактерия
развивается в видимую колонию на питательной агаровой среде. Таким
214
образом, количество колоний совпадает с количеством бактерий,
содержащихся в образце. В этой процедуре небольшой измеренный объем (или
вес) смешивается с большим объемом стерильной воды или физиологического
раствора, называемого разбавителями или бланком разбавления. Разведения
обычно делаются кратными десяти. Однократное разведение рассчитывается
следующим образом:
Dilution =Volume of the sample/Total volume of the sample and the diluents
Последовательные разбавления затем получают путем переноса
известного объема разбавления на вторую заготовку для разбавления и т. Д.
После разбавления указанный объем разведенной пробы (1 мл или 0,1 мл) из
различных разведений добавляют в стерильные пластины Петри (в трех
экземплярах для каждого разведения), к которым добавляют расплавленную и
охлажденную (45-50°С) подходящую агаровую среду. Колонии
подсчитываются на счетчике колоний Квебека. Количество организмов,
развившихся на пластинках после инкубационного периода 24-48 часов на мл,
получают путем умножения числа колоний, полученных на пластинке, на
коэффициент разбавления, который является обратной величиной разбавления.
Чтобы облегчить вычисления, разбавление записывается в экспоненциальной
нотации. Например, разбавление 1:1000 будет записано как 10-3.
Необходимый материал
Образец или бактериальная суспензия, 9 мл разведенных заготовок (7),
стерильные пластины Петри (12), стерильные пипетки по 1 мл (7), питательная
агаровая среда (200 мл), счетчик колоний.
Методика
Маркируйте заготовки для разбавления следующим образом 10-1, 10-2,
10-4, 10-5, 10-6, и 10-7. Приготовьте исходное разведение, добавив 1 мл или 1
г образца в 9 мл разведенной заготовки с маркировкой 10-1, разбавив таким
215
образом исходный образец в 10 раз (1/1x1/10 = 1/10 и записывается 1:10 или 10
-
1
). Смешайте содержимое, перекатывая трубку между руками, чтобы получить
равномерное распределение организмов (клеток). Из первого разведения
переносят 1 мл суспензии во время движения на заготовку для разведения 10-2
стерильной и свежей пипеткой объемом 1 мл, разбавляя исходный
образец/суспензию в 100 раз (1/10x1/10 = 1/100 или 10-2).
Из суспензии 10-2 переносят 1 мл суспензии на 10-3 разведения
заготовки свежей стерильной пипеткой, таким образом разбавляя исходный
образец в 1000 раз (1:1000 или 10-3). Повторяйте эту процедуру до тех пор,
пока исходный образец не будет разбавлен 10000000 (10-7) раз, каждый раз
используя свежую стерильную пипетку.
Из соответствующих разведений (от 10-1 до 10-7) переносят 1 мл или 0,1
мл суспензии во время движения с помощью соответствующих пипеток в
стерильные чашки Петри. Для каждого разведения используют три чашки
Петри (если покрыть 0,1 мл, то разведение увеличивают в 10 раз). Добавьте
примерно 15 мл питательной среды, расплавленной и охлажденной до 45°C, к
каждой пластине Петри, содержащей разбавленный образец. Смешайте
содержимое каждой тарелки, осторожно вращая, чтобы распределить клетки
по всей среде. Дайте пластинам затвердеть. Инкубируйте эти пластины в
перевернутом положении в течение 24-48 часов при температуре 37°C.
Наблюдайте за всеми пластинками на предмет появления бактериальных
колоний. Подсчитайте количество колоний в пластинах, которые имеют
колонии в диапазоне 30-300, поместив каждую пластину одну за другой на
платформу счетчика колоний Квебека.
25.2. Подсчет бактериальной популяции с помощью спектрофотометра
Бактериальная популяция или количество роста могут быть определены
путем измерения мутности или оптической плотности (т. Е. помутнения
суспензии) бульонной культуры. Чем мутнее суспензия, тем меньше света
будет проходить через нее. Поскольку мутность прямо пропорциональна
216
количеству клеток, это свойство используется в качестве индикатора
концентрации бактерий в образце. Мутность определяется количественно с
помощью спектрофотометра, который измеряет количество света, прошедшего
или поглощенного непосредственно через образец. Он пропускает луч света на
одной длине волны через жидкую культуру. Клетки, взвешенные в культуре,
прерывают прохождение света, позволяя меньшему количеству света достичь
фотоэлемента, и количество световой энергии, проходящей через суспензию,
измеряется в процентах от пропускания или % T (то есть количество света,
проходящего через суспензию) на спектрофотометре от нуля до 100 процентов.
Плотность клеточной суспензии выражается как поглощение или оптическая
плотность (величина, полученная из процента пропускания), которая прямо
пропорциональна концентрации клеток. Поглощение является
логарифмическим значением и используется для построения графика роста
бактерий.
Необходимый материал
Пробирки, каждая из которых содержала 5 мл питательного бульона (13),
24-часовую культуру питательного бульона бактерий, стерильную
серологическую пипетку объемом 1 мл, спектрофотометр Bausch & Lomb
Spectronic 20, горелку Бунзена.
Методика
Используя стерильную пипетку объемом 1 мл, инокулируйте шесть
меченых пробирок (как 0, 2, 4, 6, 8, 16, и 24) питательного бульона каждый с
0,1 мл бактериальной культуры. Остальные семь пробирок с неинвазивным
бульоном служат заготовками для настройки спектрофотометра. Инкубируйте
все 13 пробирок при температуре 30°C в течение 24 часов.
Наблюдайте за инокулированными культурами после инкубации с
интервалом 0, 2, 4, 6, 8, 12, и 24 часа для количества роста, которое
определяется путем измерения мутности (т. е. процента пропускания)
инокулированного бульона с помощью спектрофотометра. Шаги для
измерения % T следующие:
217
Включите спектрофотометр, вращая ручку нулевого управления по
часовой стрелке. Дайте прибору прогреться в течение 15 минут. Установите
длину волны на уровне 620 нм (миллимикрон). Отрегулируйте нулевой
регулятор, чтобы установить процент пропускания на “0” процентов (OD - 2),
переместив ручку влево. Протрите неинвазированный тюбик бульона
салфеткой, чтобы удалить все жидкости и отпечатки пальцев, которые будут
служить заготовкой. Поместите заготовку в держатель образца и закройте
крышку. Чтобы стандартизировать прибор, установите процент передачи на
100, повернув ручку вправо. Тщательно перемешайте содержимое
инокулированной пробирки (маркировка “О”). Протрите пробирку чистой и
держите в течение нескольких секунд, позволяя среде осесть. Извлеките
заготовку из держателя образца. Поместите инокулированную пробирку в
держатель образца, закройте крышку держателя и считайте процент
пропускания по шкале. Извлеките бульонную культуру из держателя образца.
Возьмите показания процентного коэффициента пропускания для всех
инокулированных трубок после желаемого периода роста и вычислите
поглощение (или оптическую плотность) для всех инокулированных трубок,
применяя следующую формулу:
Absorbance = − log x %T/100
Постройте график показаний с точки зрения поглощения в зависимости
от времени, в которое снимаются показания. Будет замечено, что мутность
некоторых инокулированных пробирок увеличивается с инкубационным
периодом, OD будет увеличиваться, а % T будет уменьшаться, что указывает
на больший рост клеточной популяции в культуре с увеличением
инкубационного периода.
Рассчитайте количество клеток на мл суспензии, умножив
соответствующий коэффициент. Записывайте данные номеров ячеек с
интервалами 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, и 10 дней или больше. Постройте график log10
218
числа клеток против дней после прививки для получения кривой роста.
Типичная кривая роста, полученная таким образом, может показывать
запаздывающую фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу
смерти.
Примечание: Количество бактериальных клеток при заданной
оптической плотности может варьировать из-за внеклеточного материала,
производимого бактериальными клетками различных видов.
Лучше использовать метод подсчета пластин для каждой измеренной
концентрации оптической плотности данного вида, чтобы вычислить
количество клеток/мл при данной оптической плотности для построения
кривой, и это может быть обычно использовано впоследствии для оценки
популяции этого вида. Как правило, 0,1 OD означает 107 кое/мл бактериальных
клеток Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Borkar, 1984).
219
26. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕДЯНОГО ЗАРОЖДЕНИЯ У
ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РАСТЕНИЙ
Сообщалось, что растительные патогенные бактерии, особенно группы
Pseudomonas syringae, обладают свойством ледяного зарождения (Gross et al.,
1983). Нуклеация льда-это способность бактерий превращать молекулы воды
или молекулы росы в лед при температуре выше 2°C. Обычно эти бактерии
превращают молекулы воды в лед при температуре 3-4°C. Эти бактерии
обычно распространены в умеренных регионах мира. Они присутствуют на
частях растений и увеличивают ущерб, наносимый морозом, благодаря своей
ледяной нуклеационной активности.
26.1. Оценка ледяных нуклеационных свойств pseudomonas сиринги
Необходимый материал
Бактериальная культура P. syringae, дистиллированная вода, морозильная
камера.
Методика
Приготовьте суспензию бактерий Pseudomonas syringae (0,1 ЕД) и
разлейте в 5 пробирок по 5 мл в каждой пробирке. Приготовьте суспензию
другого бактериального возбудителя растений (Xanthomonas) (0,1 ЕД) и
разлейте в 5 пробирок по 5 мл в каждой пробирке. Это будет служить
контролем. Инкубируйте пробирки при температуре 2, 4, 6, 8 и 10°C в течение
часа. Обратите внимание на образование льда в трубках.
Ледяные бактерии превращают воду в лед при температуре 4°C и ниже.
220
27. ПЕРЕДАЧА РАСТИТЕЛЬНЫХ ПАТОГЕННЫХ
БАКТЕРИЙ ЧЕРЕЗ ПЕРЕНОСЧИКА
Переносчики играют важную роль в передаче растительных патогенных
бактерий от растения к растению в поле и от поля к полю на большие
расстояния. Классический пример-огненная порча яблони и груши бактериями,
которые передаются через насекомых-переносчиков на большие расстояния.
Возбудитель кукурбитного увядания Erwinia передается через пятнистого жука
в поле. Эти бактериальные патогены также выживают в своем векторе и
передаются, когда этот вектор посещает здоровые растения, чтобы питаться
ими.
27.1. Передача бактерий (Xanthomonas) через личинок чешуекрылых
(пятнистых боллвормов)
Передача Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum в хлопке была
продемонстрирована Боркаром и Вермой (1981) через пятнистого боллворма и
красных хлопковых клопов. Насекомые получают бактерию из зараженных
листьев/бактериальных выделений в условиях высокой дождливой влажности
и передают ее здоровым листьям/растениям, питаясь/ползая по ним.
Необходимый материал
Пятнистые личинки боллворма, бактериальная культура, зараженные
бактерией хлопковые листья и так далее.
Методика
Кормление насекомых для приобретения бактериального возбудителя:
натощак (3-4 часа в пустых пластинах Петри) гусеницам боллворма разрешают
ползать по 48-70-часовым высоковирулентным культурам Xanthomonas
malvacearum в пластинах Петри. Точно так же другой набор боллвормов
питается больными листьями на влажной фильтровальной бумаге в тарелках
Петри или на растениях с больными листьями. Эти гусеницы после кормления
и приобретения Xanthomonas malvacearum называются нагруженными.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]