Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
291
этот период цвет маркерного красителя (бромфеноловый синий) изменится с
синего на желтый, что указывает на то, что гель полностью насыщен кислотой.
Этот этап депурирования не должен быть слишком долгим, так как мелкие
фрагменты менее прочно прикрепляются к мембране. Депурирование
рекомендуется только для фрагментов размером более 10 кб или в противном
случае они дают нечеткие полосы или мазки в конечном авторадиографе,
предположительно из-за повышенной диффузии переноса DADURING.
Денатурируйте двухцепочечную ДНК для создания подходящих
мишеней гибридизации путем инкубации геля с денатурационным буфером,
содержащим 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCl, в течение 15-30 минут при легком
встряхивании. (Во время денатурации бромфеноловый синий восстановит свой
цвет.) Инкубируйте гель с нейтрализующим раствором, содержащим 1,5
MNaCl и 0,5 MTris-HCl рН 7,5, в течение 30 минут.
Поместите гель на платформу. Удалите все пузырьки воздуха,
застрявшие между гелем и платформой, прокатив пипетку несколько раз взад
и вперед по гелю. Окружите гель полиэтиленовой пленкой. Это гарантирует,
что буфер переноса (10× SSC) перемещается только через гель, а не вокруг
него. Поместите промокательную мембрану (нейлоновую мембрану) поверх
геля так, чтобы она покрывала всю поверхность. Удалите все пузырьки воздуха
между мембраной и гелем, как описано ранее. Поместите три предварительно
вырезанных листа бумаги Whatman 3 мм в 10× SSC и поместите их поверх
нейлоновой мембраны. Снова удалите все захваченные пузырьки воздуха, как
описано выше.
Поверх фильтровальной бумаги положите стопку сухих бумажных
полотенец или бумажных салфеток толщиной 15-20 см. (Эффективность
переноса повышается путем удаления влажных бумажных полотенец и замены
их сухими бумагами по крайней мере один раз во время переноса.) Положите
стеклянную тарелку поверх бумажных полотенец. Положите сверху на тарелку
груз (около 500 г). Разрешить перенос в течение 12-18 часов.
292
Фиксация ДНК: Сразу после переноса удалите массу, бумажные
полотенца и фильтровальную бумагу. Переверните гель и промокательную
мембрану вместе (гелевая сторона сверху) на фильтровальное бумажное
полотенце. Отметьте положение гелевых полосок на мембране шариковой
ручкой. Осторожно снимите мембрану с геля. Закрепите ДНК на кляксе либо
путем выпечки, либо путем УФ-сшивания. (УФ-сшивание обычно дает лучшие
результаты. Чтобы испечь, сначала дайте кляксе высохнуть на листе
фильтровальной бумаги, затем поместите ее между листами фильтровальной
бумаги и выпекайте при температуре 80oC. Для УФ-сшивки защитите
поверхность ДНК-стороны мембраны пластиковой пленкой, а затем
подвергните эту сторону воздействию УФ-источника в течение 3 минут.)
Сохраните промокшку, если она не используется немедленно, при комнатной
температуре, покрытой полиэтиленовой пленкой. Гибридизированная
нейлоновая мембрана с радиоактивным зондом визуализируется с помощью
авторадиографии. (См. Таблицу 31.2.)
31.3.2. Метод вестерн-блоттинга
Вестерн-блоттинг, или иммуноблоттинг, или белковый блоттинг
включает перенос белковых полос из акриламидного геля в более стабильную
и иммобилизирующую среду, такую как нитроцеллюлозная мембрана. После
переноса возможно обнаружение специфических белков с помощью антител.
Этот подход аналогичен методу переноса ДНК из агарозных гелей на
нейлоновую мембрану (Southern blotting).
Необходимый материал
Трансферный буфер (100 мл): Трис-3 г; глицин-14,4 г; дистиллированная
вода-800 мл. Отрегулируйте объем до 1000 мл с помощью метанола.
Блокирующий раствор (TBS) (100 мл). Растворите 5 г сухого молока в 10
мм Трис-HCl, рН 7,5. Добавьте 900 мг (0,9%) NaCl и 50 мкл Твина 20.
Раствор субстрата (50 мл). Растворите 30 мг 4-хлор-1-нафтола в 10 мл
метанола. Добавьте 30 мкл Н2О2 в 40 мл ст. Тщательно перемешайте эти
растворы и добавьте в кляксу (нитроцеллюлозную мембрану).
293
Первичное антитело 1:1000 разведений. Используйте 100 мкл на 100 мл.
Сделайте ИФА для определения коэффициента разбавления.
Вторичное антитело. разведения 1:500 (используйте 200 мкл на 100 мл).
Соблюдайте рекомендуемый компанией коэффициент разбавления.
Методика
Промойте неокрашенный белковый гель после электрофореза (SDSPAGE) в дистиллированной воде. Перенесите гель в трансферный буфер на 1530 минут. Отрежьте кусочки фильтровальной бумаги Ватмана № 3 и
нитроцеллюлозного листа до размера акриламидного геля. Погрузите их в
дистиллированную воду и замочите в буфере переноса на 15-30 минут.
(Фильтровальная бумага Whatman используется в качестве вспомогательного
материала. При работе с нитроцеллюлозной мембраной следует соблюдать
осторожность и избегать прикосновения к бумаге, так как отпечатки пальцев
приводят к развязыванию пептидов во время переноса.)
Соберите сэндвич следующим образом: Положите влажную
фильтровальную бумагу на отрицательную сторону промокашки. Постепенно
заливайте фильтровальную бумагу буфером переноса. Удалите все пузырьки
воздуха, прокатив пипетку по бумаге. Положите гель на бумагу. Нанесите на
гель трансферный буфер и удалите пузырьки воздуха. Поместите
нитроцеллюлозную мембрану на гель и удалите пузырьки воздуха. Смочите 3миллиметровую фильтровальную бумагу и положите ее поверх
нитроцеллюлозного листа с положительной стороны промокашки. Вылейте
буфер переноса на фильтровальную бумагу и удалите пузырьки воздуха.
Поместите положительную сторону промокашки поверх фильтровальной
бумаги. Обмотайте бутерброд резинками.
Если это полусухой промокательный аппарат, постоянно работайте при
60 вольтах в течение 2-6 часов (для мини-геля) при температуре 4oC (следуйте
инструкциям производителя). Если это влажный промокашечный аппарат,
294
держите сэндвич в промокашечном баке, содержащем переносной буфер, и
постоянно работайте при 60 вольтах в течение 2-4 часов (для мини-геля) при
комнатной температуре (следуйте инструкциям производителя). После
переноса снимите нитроцеллюлозную мембрану и высушите ее на воздухе.
Замочите мембрану (кляксу) в блокирующем растворе (Трис-буферный
физиологический раствор, TBS), содержащем сухое молоко, предпочтительно
5-процентное сухое молоко, в течение 3 часов при встряхивании. Промойте
пятно 2-3 раза с помощью TBS-Tween 20 в течение 10 минут при встряхивании.
Инкубируйте кляксу с первичным антителом (коэффициент разведения
первичного антитела можно оценить методом ИФА) в разведениях 1:1000 с
TBS в 3-процентном сухом молоке в течение 2-3 часов при встряхивании.
Мойте 2-3 раза в промежутке между 20 и каждые 10 минут встряхиванием.
Перенесите кляксу на вторичное антитело (анти-кроличий IgG) в разведениях
1:500 (следуйте рекомендациям компании) с TBS-Tween 20 и 3-процентным
мягким порошком в течение 1 часа при встряхивании. Мойте два раза в TBSTween 20 и два раза только в TBS. Развивайте цвет, добавляя раствор субстрата.
Остановите реакцию, перенеся кляксу в дистиллированную воду.
31.3.3. Флуоресцентная гибридизация in situ (fish)
Метод анализа РЫБЫ включает в себя комбинацию цитологических и
гибридизационных инструментов. Ранее гибридизация in situ (ISH) была
разработана как метод, который включал гибридизацию ДНК с радиометкой
(Pardue and Gall, 1969; John et al., 1969).
Этот метод позволял обнаруживать целые клетки путем гибридизации с
нуклеиновыми кислотами внутри клетки-мишени без изменения
морфологической целостности клеток (Moter and Göbel, 2000). РЫБА была
введена в бактериологию Джованнони и др. (1988). DeLong et al. (1989) ввели
использование флуоресцентно меченых зондов, которые заменили
радиоактивные меченые зонды для обнаружения бактерий in situ, отсюда и
название флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Флуоресцентные зонды
обладали рядом преимуществ по сравнению с радиоактивно мечеными
295
зондами, среди которых повышенная безопасность, улучшенная разрешающая
способность, сокращение шагов обнаружения, а также благодаря возможности
использования красителей с различными спектрами возбуждения и излучения
возможность обнаружения нескольких последовательностей мишеней в одном
образце.
РЫБА использует флуоресцентно-меченые зонды для обнаружения
комплементарной цели на месте, чтобы получить изображение. Используемые
зонды представляют собой синтетические полинуклеотидные нити или
короткие фрагменты днк, несущие последовательности, которые, как известно,
комплементарны определенным целевым последовательностям в
определенных хромосомных местах. Зонды FISH часто нацелены на
последовательности рибосомальной РНК или митохондриальных генов,
поскольку они в изобилии присутствуют в базах данных последовательностей
и в нескольких копиях в каждой клетке. Зонды могут быть сконструированы с
помощью компьютерного поиска “сигнатур " у целевых организмов.” Эти
сигнатурные области могут быть специфичными на разных филогенетических
уровнях в зависимости от изменчивости последовательностей молекулмишеней. Зонд содержит короткую последовательность от 15 до 20
нуклеотидов, специфичную для одного или нескольких таксонов вида, рода
или более высоких таксономических рангов. Зонд или олигонуклеотид затем
мечен флуорохромом, например карбиндоцианиновым красителем (CY3),
который может быть обнаружен с помощью флуоресцентного микроскопа.
FISH позволяет непосредственно визуализировать положение маркера на
хромосоме или расширенной молекуле ДНК. РЫБА до сих пор использовалась
для множества применений, начиная от ДНК, РНК, цитогенетического анализа
хромосом и обнаружения бактериальной 16S рРНК. РЫБА-это мощный метод
обнаружения in situ активных растущих организмов в образцах окружающей
среды.
Методика
296
Анализы на основе РЫБЫ выполняются следующими общими этапами:
(1) фиксация, (2) подготовка, (3) гибридизация, (4) промывка и (5)
визуализация и документирование.
Фиксация: Выполняется для того, чтобы проницаемость клеток
позволяла проникать зондам, а также для предотвращения деградации
нуклеиновых кислот. Эта процедура проводится с использованием сшивающих
фиксаторов, таких как альдегиды (например, формальдегид или
параформальдегид), или осаждающих фиксаторов, таких как метанол или
этанол. Осаждающие агенты являются фиксатором выбора, когда требуется
фиксация клеток, обладающих толстой клеточной стенкой, таких как
грамположительные бактерии; в то время как фиксаторы на основе альдегида
очень хорошо работают с грамотрицательными микроорганизмами. (Фиксация
приводит к потере жизнеспособности клеток, и хотя FISH живых клеток была
показана Сильверманом и Кулом [2005], возможность поглощения
олигонуклеотидных зондов живыми клетками была опровергнута более
поздними работами Аманна и Фукса [2008].)
Инкубируют ткани-мишени/клеточную суспензию (5 мкл), фиксируют на
10-луночных предметных стеклах в 4-процентном параформальдегиде в
течение ночи при температуре 4°С, далее промывают 3-4 раза 100-процентным
метанолом. Суспензию фиксированных клеток PFA можно иммобилизовать
сушкой при температуре 60°C в течение 10 минут.
Подготовка образцов: Второй этап может включать обработку
грамположительных бактерий соединениями, улучшающими проницаемость
клеток для зондов (например, лизоцимом или лизостафином; Schönhuber et al.,
1997; Wagner et al., 1998; Moter and Göbel, 2000) или, например, простое
покрытие предметных стекол желатином (Amann et al., 1990) или другими
покрывающими агентами, дегидратацию этанолом образцов, высушенных на
воздухе на предметных стеклах, или депарафинизацию парафиновых
препаратов (Boye et al., 1998). Клетки можно обезвоживать в 50-процентном,
80-процентном и 96-процентном этаноле (по 2 минуты). Подготовительный
297
этап может быть не нужен, если для проведения полной процедуры РЫБЫ не
требуется никаких специальных процедур.
Все ткани/клетки должны быть пермеабилизированы либо термическим
шоком, либо обработкой протеиназой К. Обработка тепловым шоком включает
в себя инкубацию тканей/клеток при температуре 95°C, 2 минуты и quickchill
на очень влажном льду. Обработка протеиназой К (10 мкг/мл) в течение 15
минут с последующей инкубацией в 4-процентном ПФА в течение 20 минут.
Гибридизация: Третий этап в основном включает отжиг зонда до его
целевой последовательности в клеточной рРНК. Гибридизация проводится в
жестких условиях (высокая степень гомологии между зондовой и целевой
последовательностями). В основном гибридизацию проводят с использованием
предварительно нагретого гибридизационного буфера, содержащего зонд.
Жесткость гибридизации может быть изменена путем изменения концентрации
формамида в буфере гибридизации, температуры гибридизации или
концентрации соли. Чтобы обеспечить успешную гибридизацию, температура
гибридизации должна поддерживаться ниже температуры плавления зонда,
чтобы произошел отжиг зондов до целевых последовательностей.
Эмпирическая формула может быть использована для расчета Тм
олигоунклиотида по отношению к его содержанию ГК: Тм (в °С) = 2(А + Т) +
4(Г + С) (Suggs et al., 1981). Формамид в гибридизационном буфере ослабляет
водородные связи целевой последовательности, практически понижая Тм, в то
время как уменьшение его концентрации приведет к увеличению Тм.
Формамид может играть еще одну роль в гибридизации, дестабилизируя
вторичные структуры рРНК в рибосомах и улучшая доступность проб к
целевым последовательностям.
Дайте краткую предварительную гибридизационную обработку
гибридизационным буфером (содержащим 75 мМ NaCl, 0,01% SDS, 20 мМ Tris,
10-15% формамида) путем инкубации в течение 3 часов (или в течение ночи)
при температуре 65oC. Замените смесь предварительной гибридизации смесью
гибридизации 12 мкл, содержащей 3 мкл (1 мкг/мкл) полинуклеотидных
298
зондов, и продолжайте инкубацию при температуре 65-80 ° С в течение ночи.
Чтобы избежать испарения буфера во время следующих стадий инкубации,
слайды хранят в изотонически уравновешенных камерах. Завершите
гибридизацию, промыв предметное стекло дистиллированной водой.
Промывка: Выполняется для того, чтобы опосредовать удаление
несвязанного зонда. Он выполняется в промывочном буфере, содержащем
элементы, которые ранее были описаны для гибридизационных буферов, при
сохранении строгости под контролем.
Кратковременная промывка гибридизационным буфером
сопровождается тремя начальными очень строгими промывочными
процедурами с предварительно нагретым буфером 2 × SSC (с 75%/50%/25%
гибридизационной смесью соответственно) в течение 10 минут каждая при
температуре 65°C. Затем следует более поздняя менее строгая промывка 0,2 ×
SSC буфером (с 75% /50% /25% гибридизационной смесью соответственно) в
течение 5 минут каждая при комнатной температуре.
Визуализация: Может быть выполнена либо с помощью флуоресцентной
микроскопии, либо после установки образцов в монтажную среду с
добавлением или без добавления агентов, предотвращающих выцветание
флуорохромов при интенсивном освещении, либо с помощью цитометрии.
Если используются флуоресцентно меченые зонды, клетки могут быть
проанализированы непосредственно с помощью эпифлуоресцентного
микроскопа. Держите пластины как можно дольше в темноте (цветовая реакция
светочувствительна). Остановите развитие цвета, промыв его 4-процентным
параформальдегидом. Слайды монтируются в антибликовое крепление и
анализируются с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Axioplan, Zeiss,
Германия) и соответствующих наборов фильтров для Cy3 и флуоресцеина.
Изображения снимаются с помощью ПЗС-камеры (CCD 1035 × 1317) в
сочетании с программным обеспечением WinView Image software (версия
2.1.7.6., Princeton Instruments,США) и псевдокрашиваются с помощью Adobe
Photo Deluxe, BE 1.0.
299
31.3.4. Технология микрочипов
Микрочипы с ключевыми характеристиками скорости, надежности,
надежности, простоты использования и экономической эффективности уже
оказали заметное влияние на многие области биологии растений и, вероятно,
станут стандартным инструментом лаборатории микробиологии/патологии.
Они могут быть основаны на детекции нуклеиновых кислот (либо на основе
кДНК, либо на основе олиго) или на детекции белков с потенциалом
распознавания тысяч пятен на одном чипе/слайде массива. Микрочип ДНК-это
твердая опора, на которой множество зондов захвата ДНК иммобилизовано в
высокой плотности. Паттерны гибридизации между ДНК-зондами и образцами
могут быть проанализированы для выявления различий на нуклеотидном или
транскрипционном уровне.
Разработка концепции технологии микрочипов слабо основана на
обратной стратегии северного блота, где массив специфичных для
последовательности мишеней зондов прикрепляется к твердой поверхности
путем гибридизации с мечеными молекулами-мишенями, которые
обнаруживают сигнал. То, что началось еще в 1995 году с 45 комплементарных
ДНК-зондов, обнаруженных на стеклянном предметном стекле для создания
микрочипа, с тех пор быстро эволюционировало, позволив изготовить
микрочипы с более чем миллионом функциональных зондов. Микрочипы ДНК
могут быть построены либо на основе стандартизированного формата слайдов
открытого микроскопа, либо на основе альтернативных интегрированных
стратегий, таких как те, которые используются Affymetrix в закрытом формате
“набора”.
Микрочипы были использованы для множества применений, включая
геномное генотипирование, профилирование экспрессии, обнаружение РНК,
белковых массивов и обнаружение патогенных нуклеиновых кислот. Они
обладают потенциалом для увеличения пропускной способности диагностики,
автоматизации процесса и одновременного снижения удельных затрат. В
настоящее время технология микрочипов ДНК является наиболее подходящим
300
методом для высокопроизводительного обнаружения и идентификации, а
также количественной оценки нескольких патогенов в одном анализе. Ливенс
и др. (2006) продемонстрировали полезность технологии ДНК-массивов для
обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs), которые могут быть
нацелены на идентификацию патогена и должны использоваться в любом
диагностическом анализе.
Постоянный коммерческий интерес к технологии микрочипов обещает
увеличение плотности элементов массива, повышение чувствительности
обнаружения и более дешевые и быстрые методы. Экспоненциальный рост
последовательностей нуклеиновых кислот патогенов, доступных в
общедоступных базах данных, вызвал их прямое использование в стратегиях
обнаружения, идентификации и наблюдения патогенов. Технология
микрочипов ДНК открыла потенциал для прямого анализа широкого спектра
патогенов, представляющих интерес. Однако для практического
использования этого потенциала необходимо решить многочисленные
технические проблемы.
Ключевым объединяющим принципом всех методов микрочипов
является то, что меченые молекулы нуклеиновых кислот/антител в растворе
гибридизуются с высокой чувствительностью и специфичностью с
комплементарными последовательностями, иммобилизованными на твердом
субстрате, что облегчает параллельное количественное измерение многих
различных последовательностей в сложной смеси. Они состоят из плотно
упакованных зондовых матриц на основе нуклеиновой кислоты или антител,
покрытых оптически плоскими стеклянными пластинами, содержащими 96
лунок. Основные этапы включают генерацию фрагмента ssDNA, который
должен быть обнаружен на стеклянных предметных стеклах или мембранах и
впоследствии гибридизован с мечеными зондами. Полученное
гибридизационное изображение сканируется и анализируется. Хотя было
разработано несколько методов построения микрочипов, преобладали два.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]